猪雄性生殖干细胞的分离纯化

 为了建立猪雄性生殖干细胞的分离纯化方法,以1~2周龄长白猪睾丸组织为材料,采用差异贴壁法和曲细精管培养法对猪雄性生殖干细胞进行分离纯化。结果表明：双酶消化-差异贴壁法和曲细精管培养法均能获得高活力的猪雄性生殖干细胞,但后者的富集效果较好,可以达到40.7%,前者的富集效果为 36.9%。差异贴壁法和曲细精管培养法具有操作简单、回收细胞纯度高等优点,可应用于猪雄性生殖干细胞的分离纯化。     

靶向山羊△FosB基因的shRNA重组干扰腺病毒的制备及鉴定

△FosB作为FosB的一种截短型,具有广泛的生物学功能,在脂、钙沉积和药物成瘾等方面有重要作用.本研究采用RNA干扰技术,通过制备重组干扰腺病毒对山羊(Caprar hircus)△FosB基因进行沉默,进一步研究山羊△FosB基因在脂、钙沉积方面的相关功能及作用机制.实验采用BLOCK-iT slaRNA腺病毒干扰系统,将预先设计好的寡聚shRNA-492/572经退火复性后克隆入穿梭质粒pENTR/CMV-GFP/U6中.经干扰效率检测后,选择pENTR/CMV-GFP/U6-572与病毒骨架质粒pAD/PL-DEST进行同源重组,获得重组干扰腺病毒载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-572,并转染HEK-293细胞,经包装、扩增后即可产生干扰腺病毒AD-△FosB-572,TCID50法测定其滴度为1.58x109 PFU/mL.用AD-△FosB-572感染山羊的乳腺上皮细胞(MOI=200),经Western blot及实时定量PCR检测证明在病毒感染24、48和72 h后,山羊乳腺上皮细胞中△FosBmRNA表达量分别下调了45%,73%和81%,其蛋白表达水平也明显下调,干扰效果明显,可用于后续的基因功能研究.     

长链非编码RNA AK005183干扰载体构建及慢病毒包装

为研究长链非编码RNA AK005183在精子发生中的功能,设计、合成了干扰AK005183表达的shRNA序列,并构建其干扰表达重组慢病毒载体CD513B-U6-AK005183,将干扰表达质粒及对照质粒分别转染NIH3T3细胞系,实时定量PCR检测CD513B-U6-AK005183质粒对AK005183的表达具有较好的干扰效果。利用第三代慢病毒包装系统,将CD513B-U6-AK005183、pGag-Pol、pRsv-rev、pVSV-G质粒共转染293T细胞系,包装得到滴度为5×106 TU/mL的干扰表达重组慢病毒。用CD513B-U6-AK005183慢病毒转导GC-1spg细胞系,检测到AK005183的表达下调64%。表明本研究成功构建并包装得到高效干扰长链非编码RNA AK005183表达的重组慢病毒,将为深入研究长链非编码RNA在精子发生过程中的功能奠定了基础。     

山羊PTHrP基因的多克隆抗体制备和组织表达图谱分析

旨在获得山羊PTHrP多克隆抗体,检测其在山羊各组织中的表达图谱,以便进一步研究山羊PTHrP的功能。本研究构建山羊PTHrP基因的原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达获得融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测融合蛋白,然后将融合蛋白纯化后多点免疫大耳白兔,制备多克隆抗体,最后使用West-ern blot检测PTHrP在山羊各组织中的表达。结果,酶切和测序显示原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳结果说明融合蛋白(约36.5 ku)被成功纯化;间接ELISA检测所制备的抗体效价达1∶51 200;表达谱显示PTHrP在山羊乳腺、肾脏、垂体、脑、心脏、肝脏、骨、肌肉、脾脏等组织中均有表达。本研究成功制备了山羊PTHrP的多克隆抗体,发现PTHrP在山羊各组织中广泛表达。     

小鼠miR-125a超表达载体的构建

为了探明miR-125a在精子发生中的功能,以小鼠基因组DNA为模板扩增miR-125a的前体片段(pre-miR-125a),经过双酶切后连接入质粒pcDNA3.1(+),构建miR-125a超表达载体(pcDNA3.1(+)-miR-125a);将pcDNA3.1(+)-miR-125a转染至GC-1spg细胞系,通过qRT-PCR和Western Blot验证其超表达效果。结果表明:PCR扩增得到约290bp的miR-125a前体片段,成功构建了pcDNA3.1(+)-miR-125a过表达载体,在GC-1spg生殖细胞系中约有3.5倍的超表达效果,为深入研究miRNAs在精子发生过程的功能及其机制奠定基础。