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1.
将35头40日龄猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)抗原及抗体均为阴性的健康仔猪,随机分成7组,每组5头,命名为XJ1~XJ7组。XJ1~XJ6组分别免疫PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株,接种剂量分别为102TCID50/头、103TCID50/头、104TCID50/头、105TCID50/头、106TCID50/头和107TCID50/头,XJ7组为对照组,按1mL/头剂量接种DMEM。各试验组在免疫后28 d,用3×104.0TCID50/头剂量感染HP-PRRSV HuN4第5代强毒,疫苗免疫和攻毒后观察和检测各组试验猪的免疫效果。结果表明:攻毒前XJ2-XJ6组PRRSV ELISA抗体在免疫后14 d全部转为阳性,XJ1组在免疫后21 d转为阳性,但维持在较低水平;XJ2-XJ6组针对标记基因NP49的特异性抗体在免疫后28 d转阳性。攻毒后对照组全部发病,且死亡2头,XJ1有4头发病,XJ2-XJ6组无发病和死亡,本研究结果表明PRRSV基因工程双标记疫苗rHN4-△25+NP49株对仔猪提供免疫保护的最小免疫剂量为103TCID50/头。 相似文献
2.
猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)rHN4-△25+NP49株是新型基因标记弱毒疫苗候选株,为了配合对该基因标记疫苗免疫猪血清抗体的鉴别诊断,本研究以标记基因编码的NP49(新城疫病毒NP蛋白C末端49个氨基酸,即NP49)多肽作为包被抗原,建立标记疫苗免疫猪血清中NP49抗体的ELISA鉴别诊断方法。通过对NP49-ELISA工作条件的优化,结果显示NP49-ELISA的多肽抗原最适包被浓度为500ng/孔,被检血清最佳稀释度为1:40。利用ROC曲线法确定S/P临界值为0.2,该方法批内与批间重复试验的变异系数均小于10%,与几种常见猪病阳性血清无交叉反应,具有较好重复性和特异性。本研究建立的NP49.ELISA鉴别诊断方法为猪繁殖与呼吸综合征新型基因标记疫苗的临床应用提供了有力保障。 相似文献
3.
为了构建猪流感病毒A/swine/Tian Jin/6/2013(H1N1)的反向遗传操作技术平台,通过RT-PCR技术分别扩增了欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的8个基因片段,并分别连接至双向转录表达载体p BD上。纯化8个重组质粒,共转染到293T细胞。54 h后收集上清,并接种到MDCK细胞。待细胞病变明显时,进行血凝试验检测收集到的上清,测得血凝效价为1∶32。测定拯救病毒的全基因组序列,结果显示,在核苷酸序列上,拯救病毒与野生病毒完全一致。细胞病变情况显示,拯救毒株与野生毒株无明显差别。本研究成功拯救了欧洲类禽H1 N1亚型猪流感病毒,为猪流感病毒的致病机理、基因功能研究以及H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研发奠定了基础。 相似文献
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为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。 相似文献
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我国猪群中TTV的鉴定及其分子流行病学分析 总被引:8,自引:2,他引:8
为了确定Torque teno virus(TTV)在我国猪群中是否存在及其感染情况,本研究利用套式PCR方法首次检测了来自广东、福建和江西等7个省份的258份血液样品和组织样品.结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性卒分别为37.6%和82.6%.两者的混合感染率为38.4%.挑选部分阳性样品用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分非编码区(UTR)片段,并将扩增出的部分UTR基因与已报道的TTV1和TTV2病毒UTR序列进行比较分析,同时我们选择了8份阳性样品进行了TTV1和TTV2的全长基因的扩增和克隆.分析结果显示TTV可分为TTV1和TTV2两大分支,其中我们分离获得的TTV1和TTV2之间的UTR核苷酸同源性分别为80.8%~98.5%和94.2%~100%,而与参考株相比同源性分别为82.7%~100%和95.5%~99.1%.本研究首次证实在我国猪群中存在TTV感染,提示我们对猪群感染的TTV是一个不容忽视的新病原. 相似文献
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根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4(Nonstructural protein 4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21(DE3),诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Westernblot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析(Ni-NTA)纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB/c小鼠,抗血清ELISA效价达1:16000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。 相似文献
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为鉴定乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白I,II结构域抗原表位,本研究设计了一系列针对E蛋白的I、II结构域(1aa~296aa)部分重叠短肽,分别进行GST融合表达,用JEV阳性血清进行western blot和ELISA反应性筛选,获得了5个线性抗原表位分别为:E1(1FNCLGMGNRDFIEGAS16)、E10-4(77TGEAHNEK84)、E11-2(83EKRADSS YVCKQ94)、E19(145GTTTSENHGNYSAQVG160)和E33(257SQEGGLHHALAGAIVV272)。除E10和E19外,其它表位均为第一次通过实验方法确定的。将这5个融合蛋白对小鼠进行免疫,获得了高滴度的针对5个融合短肽的抗血清,研究证明了这些表位具有良好的免疫原性。本研究为乙型脑炎特异性诊断试剂及表位疫苗的开发奠定了基础。 相似文献
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为研究表达猪源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在动物体内的免疫调节特性及对其的保护效力评价,本研究将15头30日龄仔猪随机分成4组,空白对照组(DMEM)4头、疫苗对照组(HuN4-F112株)4头、疫苗组(rPRRSV-GM-CSF株)3头和攻毒对照组(DMEM+HuN4株)4头。疫苗对照组肌注免疫HuN4-F112株105 TCID50/头、疫苗组肌注免疫rPRRSV-GM-CSF株105 TCID50/头,实验空白组和攻毒对照组肌注DMEM 2 mL/头,免疫后28 d,疫苗组、疫苗对照组和攻毒对照组肌注HuN4株(105 TCID50/头)。攻毒后的试验结果表明,免疫rPRRSV-GM-CSF重组病毒组和疫苗株HuN4-F112组获得完全保护,阴性对照组全部死亡;通过IDEXX试剂盒检测仔猪血清中PRRSV抗体水平可知,在免疫14 d后,疫苗组抗体水平显著高于疫苗对照组(P<0.05);由... 相似文献
10.
为了配合(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)基因标记疫苗株(rHN4-Δ25+NP49株)的临床抗体鉴别诊断应用,本研究以标记疫苗中缺失的25个氨基酸多肽作为包被抗原,通过对ELISA反应条件的优化,确定抗原最适包被浓度为500 ng/孔,血清最佳稀释度为1:40,同时确定其阴阳性临界值S/P判定标准为0.15,批内和批间重复实验结果显示其变异系数均低于10%,表明该方法具有良好的重复性。对临床血清检测结果显示与IDEXX试剂盒检测结果的符合率为94.84%,采用25 aa负标记ELISA方法检测HuN4-F112免疫猪血清,结果显示从免疫后21 d可检测25 aa特异性抗体,该抗体至少可持续存在126 d。本研究建立的ELISA检测方法为今后PRRSV基因工程标记弱毒疫苗株在临床鉴别诊断的应用提供了有利保障。 相似文献