鱼源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS在枯草芽胞杆菌中的表达及检测

用PCR方法从枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、鱼源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的基因组DNA和质粒pGFP-2中,分别扩增P43启动子、不含信号肽的外膜蛋白基因ompTS和不含启动子的绿色荧光蛋白基因.各PCR产物经测序、酶切、连接到大肠杆菌(Escherichia coli)-枯草芽胞杆菌穿梭载体pNW33N相应位点分别构建了穿梭表达载体pNWP43gfp和pN-WP43omp.电转枯草芽胞杆菌构建菌株BS01(pNWP43gfp),在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光;电转枯草芽胞杆菌构建菌株BS01(pNWP43omp),表达的外膜蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明,穿梭表达载体pNWP43gfp和pNWP43omp构建成功.构建的枯草芽胞杆菌在P43启动子的调控下,分别实现了绿色荧光蛋白基因和外膜蛋白基因ompTS的表达.     

口蹄疫的预防与防制策略

口蹄疫被OIE列为A类传染病之首,我国将其列为一类动物疫病,其发病特征是传播途径多,传播速度快,传染性强,病原变异大,危害严重等,因此曾多次在世界上引起流行。口蹄疫发病后会导致病畜口、蹄部出现大量水泡,高烧不退等症状。病毒一般在发病动物的咽、喉、食道部上皮产生水泡,随后出现病毒血症,扩散到全身组织器官。幼龄动物常常以口腔、蹄部、乳房发生水泡和烂斑为特征。1国家控制口蹄疫方面采取的重大措施     

生长抑素噬菌体展示鼠源单链抗体库的构建与鉴定

应用噬菌体表面展示技术,从生长抑素免疫的小鼠脾脏中提取总RNA,用RT-PCR技术反转录成cDNA,通过PCR扩增出抗体重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因,再用编码(G1y4Ser)3的Linker在体外将VH和VL连接成单链抗体(ScFv)基因,克降到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至感受态的大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07超感染,形成噬菌体单链抗体库,有效库容为9.3×107。为利用亲和富集筛选技术,获得具有与SS结合活性的完整重组噬菌粒克隆奠定了基础。     

鱼源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS在枯草芽孢杆菌中的表达及检测

用PCR方法从枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、鱼源嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的基因组DNA和质粒pGFP-2中,分别扩增P43启动子、不含信号肽的外膜蛋白基因ompTS和不含启动子的绿色荧光蛋白基因。各PCR产物经测序、酶切、连接到大肠杆菌（Escherichia coli）-枯草芽胞杆菌穿梭载体pNW33N相应位点分别构建了穿梭表达载体pNWP43gfp和pN-WP43omp。电转枯草芽胞杆菌构建菌株BS01（pNWP43gfp）,在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光;电转枯草芽胞杆菌构建菌株BS01（pNWP43omp）,表达的外膜蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明,穿梭表达载体pNWP43gfp和pNWP43omp构建成功。构建的枯草芽胞杆菌在P43启动子的调控下,分别实现了绿色荧光蛋白基因和外膜蛋白基因ompTS的表达。     

鱼源嗜水气单胞菌aopB-/aopD-/aroA-缺失株的构建及鉴定

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)能引起多种鱼类暴发性出血性败血症,为研制更加安全的嗜水气单胞菌口服活疫苗,构建了鱼源嗜水气单胞菌aopB-/aopD-/aroA-缺失株。首先构建含缺失369 bp的aopB/aopD基因(编码嗜水气单胞菌外膜蛋白B、D)与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒pREaopB/aopD,与嗜水气单胞菌Ah2056接合转移,应用二步法筛选aopB-/aopD-缺失株,PCR证实aopB/aopD基因的缺失突变。在此基础上,构建另一个含缺失1 290 bp的aroA基因(编码5-酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)与庆大霉素抗性片段（aacC1片段）的重组自杀性质粒pSUParoA,与aopB-/aopD-缺失株接合转移,利用庆大霉素抗性筛选aopB-/aopD-/aroA-缺失株,用PCR证实aroA基因的缺失突变。进一步对aopB-/aopD--/aroA-缺失株进行生长特性、对鱼的毒力等生物学特性鉴定。结果表明,aopB-/aopD-/aroA-缺失株构建成功,且该缺失株为毒力丧失、营养缺陷株。