猪源PIV5毒株的全基因组序列测定及其生长特性研究

副流感病毒5型(PIV5)是一种副黏病毒,能感染包括人、猪、牛、马、小熊猫、东北虎等在内的多种哺乳动物而没有明显的致病性.近年来,在我国多个地区和省份从多种动物体内分离到该病毒.参照PIV5 ZJQ-221株全基因组序列设计覆盖HLJ2015/DP2-1/PIV5株(GenBank登录号为MT890697)、JX/12...     

表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

通过双酶切将伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)Fa株gC囊膜糖蛋白基因片段亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中,得到pDC316-gC。用此质粒与腺病毒DNA辅助质粒pBHGloxΔ E1,3Cre共转染293细胞,包装出重组腺病毒Adv-gC。通过PCR鉴定和病毒空斑纯化,得到纯的高效价Adv-gC病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达PRV gC蛋白。该病毒经肌注免疫Balb/c小鼠,能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应。攻毒试验表明,此重组病毒能提供100%的免疫保护。     

淀粉卵甲藻的危害与诊治

近年来，由于大黄鱼高密度非规范化养殖，海水污染等造成水质严重恶化，不少养殖户利用海区围垦池塘网箱养殖大黄鱼，因池塘内水体交换少，水流小以及其它外界因子的影响，易造成淀粉卵甲藻的大量繁殖，导致对大黄鱼等养殖鱼类的严重危害，现报告闽东地区发生的病例。１　病原　病原为眼点淀粉卵涡鞭虫（Ａｍｙｌｏｏｄｉｎｉｕｍｏｃｅｌｌａｔｕｍ），属于肉鞭动物门、鞭毛亚门、植鞭纲、腰鞭目、胚乳科。该虫的营养体（ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ，ｔｒｏｐｈｏｎｔ），初期为梨形，后期则近于球形，大小为２０～１５０μｍ，最大的达３５０…     

表达PRRSV GP2a/GP2b、GP3、GP4、GP5和M蛋白重组腺病毒的构建

以PRRSV FJ-1a株为模板,采用RT-PCR法分别扩增出GP2a/GP2b-3、GP3、GP4、GP5和M蛋白基因片段,双酶切后插入穿梭质粒pDC316.利用AdMaxTM法,将5个重组穿梭质粒分别与腺病毒辅助质粒共转染293细胞,得到重组腺病毒Ad-GP2a/GP2b-3、Ad-GP3、Ad-GP4、Ad-GP5和Ad-M.重组腺病毒滴度为107.7～109.0TCID50·mL-1,而以Ad-GP5滴度最低,仅为107.7TCID50·mL-1.PCR检测第3、6、9代重组腺病毒稳定性,确证重组病毒均能稳定携带目的基因.对目的基因转录的RT-PCR鉴定结果显示,重组腺病毒分别感染293细胞后能转录产生目的基因mRNA.表达PRRSV主要囊膜蛋白基因重组腺病毒的获得,为进一步研制PRRSV基因工程疫苗,解析主要囊膜蛋白功能奠定基础.     

表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

通过双酶切将伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)Fa株gC囊膜糖蛋白基因片断亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中，得到pDC316-gC。用此质粒与腺病毒DNA辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293细胞,初步成功包装出重组腺病毒Adv-gC。进一步通过PCR鉴定和病毒空斑纯化，得到纯的高效价Adv-gC病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达PRV gC蛋白。该病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,结果表明能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应，即针对gC蛋白的总抗体IgG、针对PRV的中和抗体和足垫迟发型超敏反应DTH。攻毒实验表明，此重组病毒能提供100％的免疫保护，而对照组为0%。表达PRV gC基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其免疫效果的初步测试，为研制PRV新型活载体疫苗奠定了基础。     

猪瘟病毒E0基因在CHO细胞中的表达

将EGFPE0融合基因插入哺乳动物细胞表达载体pCI-dhfr中,构建重组质粒pCI-EGFPE0。将重组质粒转染CHO(dhfr-),在荧光显微镜下观察到少数细胞呈现绿色荧光,表明转染成功。通过MTX加压筛选后,在荧光显微镜下观察到多数细胞呈现强绿色荧光,表明重组融合蛋白EGFPE0在CHO细胞中得到大量表达。高效表达重组融合蛋白细胞克隆的获得为进一步大量制备可溶性的猪瘟病毒E0糖蛋白、制备其单抗筛选抗原表位及研究E0蛋白的生物学功能奠定基础。     

猪瘟病毒EO基因在CHO细胞中的表达

将EGFPEO融合基因插入哺乳动物细胞表达载体pCI-dhfr中,构建重组质粒pCI-EGFPE0.将重组质粒转染CHO(dhfr'),在荧光显微镜下观察到少数细胞呈现绿色荧光,表明转染成功.通过MTX加压筛选后,在荧光显微镜下观察到多数细胞呈现强绿色荧光,表明重组融合蛋白EGFPE0在CHO细胞中得到大量表达.高效表达重组融合蛋白细胞克隆的获得为进一步大量制备可溶性的猪瘟病毒E0糖蛋白、制备其单抗筛选抗原表位及研究E0蛋白的生物学功能奠定基础.     

基于漏磁内检测的管道补口失效识别与判定方法

管道补口一旦发生失效,腐蚀介质自破损处渗入,将会严重影响管道完整性。基于漏磁内检测原理和管道补口失效形式,提出了补口防腐失效的识别与判定流程:通过分析管道补口结构特点、失效形式、可能产生腐蚀缺陷的位置与形貌特征,明确管道补口失效导致外腐蚀特征及其与漏磁内检测信号特征之间的对应关系,从而识别可能已经失效的管道补口。通过对多条管道的开挖验证,得出采用漏磁内检测技术识别与判定补口失效准确率,并验证了该方法的准确性,为基于漏磁内检测的补口失效识别与判定技术的工业化应用奠定了基础。(图7,表1,参20)     

猪盖塔病毒感染性克隆构建及病毒拯救

为研究盖塔病毒(GETV)致病机制,需搭建可靠的盖塔病毒(GETV)反向遗传操作平台。首先构建GETV/HuN1株的全长感染性克隆质粒,并在nsP4基因与C基因之间或E1基因与3′UTR之间插入亚基因组启动子26S和报告基因EGFP,将3个重组质粒分别转染至BHK-21细胞中,拯救病毒,鉴定重组病毒和外源基因稳定性,测定病毒滴度并绘制生长曲线。以重组质粒pACYC-177-GETV为模板进行RT-PCR扩增,结果显示,GETV每个蛋白基因均能正确扩增出相应条带。IFA鉴定结果显示,E2与6K蛋白抗体能与rGETV特异性结合。将EGFP基因分别插入到C基因的上游或E1基因的下游,产生报告病毒rGETV-EGFP/C和rGETV-EGFP/E1。在2种报告病毒感染的BHK-21细胞上均能观察到EGFP高表达,将报告基因插入E1基因下游,可保持其更高的稳定性。此外,生长曲线显示,重组病毒具有与亲代病毒相似的生长速度。综上,GETV反向遗传操作平台的成功建立为研究GETV蛋白功能和研发疫苗奠定了基础。     

鱼源气单胞菌的分离鉴定及血清学调查

应用生化鉴定和PCR技术对1999～2001年主要分离自福建省患典型败血症鳗鲡的气单胞菌进行精细的鉴定，结果共得到气单胞菌115株，其中嗜水气单胞菌69株，温和气单胞菌29株，豚鼠气单胞菌2株和未定种气单胞菌15株。45株可被典型分型于5个主要血清型；福建鳖源嗜水气单胞菌优势血清型为O：Ah10501，鳗源气单胞菌分离株主要分布于0：Ahl0501、O：YT-1、0：CHS-3和O：CQ-1等4个血清型。非福建分离株则集中分布在O：Ah9617(0：9)。LPSs免疫印迹法既能用于不同血清型菌株脂多糖的结构分析，又能对常规血清学分型结果进行校正，其结果更直观、准确。