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为分析猫泛白细胞减少症病毒(FPV)北京株(FPV-BJ 05株)NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007 bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%~99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%~98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。 相似文献
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采用RT-PCR方法从甲型鸭肝炎病毒ZJ-V株的RNA模板中扩增出2A基因,将其克隆到表达载体pET-30(+)中,经酶切和测序鉴定后转化表达宿主菌BL21(DE3)细胞中,以IPTG诱导表达His-DHAV-2A融合蛋白.结果表明:目的蛋白在1mmol/L IPTG诱导4h的情况下以可溶性形式表达.表达产物经Ni柱纯化后获得了高纯度的融合蛋白.以纯化后的His-DHAV-2A融合蛋白为抗原免疫白兔制备多抗,Western-blot试验表明制备的多抗可与目的蛋白发生特异性反应.以上结果说明,DHAV的2A蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多抗血清可用于2A蛋白的表达检测. 相似文献
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【目的】 了解并掌握鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。【方法】 通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病毒分离,用RT-PCR、透射电镜观察、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)等方法鉴定,进行动物回归试验测定病毒毒力并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析。【结果】 分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30~60 nm的病毒粒子;RT-PCR结果显示,在约270 bp处可见单一条带,与DTMUV预期大小一致;Western blotting结果显示,在60 ku处有特异性条带,与E蛋白大小一致;IFA结果表明,接种病毒的DF-1细胞胞质中可见明亮的特异性荧光,以上结果均表明分离的病毒为DTMUV。将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌内注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远。与商品灭活疫苗毒株HB2010株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比,AX2020株第93、277和487位氨基酸发生了的突变。【结论】 成功分离得到1株DTMUV AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。 相似文献
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采用GB3838-2002作为评价标准和实测资料,对韶关市区主要地表饮用水源地水质的年平均值随年份变化趋势进行分析,较为全面地阐述了水质现状、变化趋势及成因,得出水源地未达到Ⅱ类保护目标和砷已对水源地构成安全隐患的结论。提出保护好水源地的一些建议,为当地政府决策部门的决策提供依据,同时也让更多的市民从中了解当地水源地的情况,提高市民对保护饮用水源地重要性的认识,达成人人参与共同保护的共识。 相似文献
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采用GB38388-2002作为评价标准和实测资料,对韶关市区主要地表达饮用水源地水质的年平均值随年份变化趋势进行分析,较为全面地阐述了水质现状,变化趋势及成因,得出水源地未达到2类保护目标和砷已对水源地构成安全隐患的结论.提出保护好水源地的一些建议,为当地政府决策部门的决策提供依据,同时也让更多的市民从中了解当地水源地的情况,提高市民对保护用水源地重要性的认识,达成人人参与共同保护的共识. 相似文献
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为研究A型鸭肝炎病毒(DHAV)非编码区的结构和功能,笔者拟构建该病毒的微基因组并对其进行初步鉴定。采用酶切的方法将萤火虫荧光素酶报告基因(fLuc)与A型鸭肝炎病毒的ORF进行替换;并在5′UTR上游插入海肾荧光素酶报告基因Rluc作为内参基因;同时还在Rluc上游引入锤头状核酶,3′UTR下游引入丁型肝炎核酶,至此得到了含有双报告基因的A型鸭肝炎病毒微基因组(pRluc-fLuc)。将pRluc-fLuc转染DF-1细胞,8h便可以检测到报告基因的表达,24h表达量达到峰值。上述结果表明,已经成功构建了A型鸭肝炎病毒微基因组,这为进一步研究病毒非编码区的结构和功能以及病毒的翻译或复制的调控机理提供了良好的技术平台。 相似文献
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为建立一种检测兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)抗体的间接ELISA方法,首先扩增了VP60的优势抗原区A(31~250 aa)和B(470~579 aa)两个片段,然后应用融合PCR方法将A、B片段连接起来,克隆至pET-30a(+),转染BL21感受态细胞,进行原核表达。用Western blot方法对表达产物(AB)的免疫原性进行鉴定,再以纯化的AB为诊断抗原,通过对抗原-抗体反应条件的多重优化,建立检测RHDV抗体的间接ELISA方法。试验结果表明,本研究成功表达了RHDV VP60的优势抗原区(AB),重组蛋白的分子量约为36 kDa,该蛋白能与RHDV抗体发生特异性反应。以纯化的AB为包被抗原,成功建立了检测RHDV抗体的间接ELISA方法。经过对部分田间样品的检测和应用,证明该方法具有特异性强、重复性好、敏感性高等优点。本研究为将来开展RHDV的流行病学调查和疫苗研究等提供了良好的技术手段。 相似文献
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本试验对猪脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)2A蛋白进行原核表达和纯化。采用大肠杆菌原核表达系统,将EMCV 2A基因插入原核表达载体pET-28a-sumo中构建重组原核表达质粒pET28a-EMCV-2A,经PCR和测序鉴定无误。将重组原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,超声破碎后,2A蛋白的表达主要以包涵体形式存在。通过优化蛋白表达条件,使目的蛋白能够实现可溶性表达。利用磁珠纯化方法对重组蛋白进行纯化,并以SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,本试验成功构建2A的重组表达质粒;重组蛋白分子质量约为25 ku,与预期大小一致;IPTG浓度1.0 mmol/L、16 ℃低温诱导16 h为最佳诱导条件,约有50%的蛋白呈现可溶性表达;纯化后获得2A重组蛋白。本试验通过对EMCV 2A蛋白的原核表达及纯化,成功获得纯度较高的EMCV 2A蛋白,为进一步阐明EMCV的分子致病机制以及研发基因疫苗和抗病毒药物奠定基础。 相似文献