喜树丛枝植原体的分子鉴定及TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

 为确定在云南文山地区喜树上发生的疑似丛枝病的病原种类及快速检测喜树丛枝病,本研究利用植原体16S rDNA基因通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2对感病喜树总DNA进行常规PCR和巢式PCR扩增、克隆和测序,通过系统进化分析,明确了喜树丛枝植原体属于16SrXXXII组。然后根据喜树丛枝病植原体16S rDNA基因保守区域设计并合成特异性引物和TaqMan探针,制备了喜树丛枝病植原体标准质粒,确定了最优引物浓度和最佳探针浓度,制作的标准曲线有极好的线性关系,决定系数(R²)达到0.999,建立的实时荧光定量PCR检测方法能够特异性地检测喜树丛枝植原体。本研究首次明确了喜树丛枝植原体的分类地位,优化和建立了喜树丛枝植原体TaqMan探针qPCR检测方法,为快速检测喜树丛枝病植原体提供参考。     

植原体分类研究进展

目的明确云南元谋地区发生的萝卜花变叶病病原以及赤霉素合成途径中关键酶基因表达量的变化。方法对自然表现花变叶、丛枝和节间缩短的萝卜感病植株总DNA进行植原体16S rRNA基因扩增、克隆、测序及系统进化树构建,并采用实时荧光定量PCR技术分析赤霉素合成及代谢途径中关键酶基因(GA20ox1、GA3ox1和GA2ox1)表达量的变化。结果该植原体株系与16SrII-A亚组相似性最高(0.98),并与16SrII-A亚组中的其他植原体株系明显形成一个进化支。结论萝卜花变叶植原体(Raphanus sativus phyllody,RsPh-YNym)为植原体16SrII-A亚组成员,且与候选种Candidatus Phytoplasma aurantifolia相关,明确了该株系的分类地位;感病植株茎中3种关键酶基因GA20ox1、GA3ox1和GA2ox1表达水平发生了变化,表达量均下调,说明植原体的侵染造成了植株赤霉素稳态被破坏,从而导致植株表型改变。     

基于线粒体COⅠ基因及形态特征的喜树丛枝植原体主要媒介昆虫种类鉴定

植原体病害是喜树上危害最严重的病害之一,传播喜树植原体病害的主要媒介昆虫是喜树上的一种小绿叶蝉,为进一步分析媒介昆虫传播植原体机制以及植原体在昆虫体内的侵染循环过程,为植原体病害的科学防控提供参考,媒介昆虫的种类及分类地位必须先行明确。通过网捕法采集云南文山喜树上的小绿叶蝉标本,在体视显微镜下根据各龄期外部形态以及雄性外生殖器特征进行种类鉴定,结合PCR扩增线粒体COⅠ基因序列片段进行测序和比对,利用Kimura 2-parameter模型计算出平均遗传距离并用最大似然法构建系统发育树,进一步明确其分类地位,再根据前人制作的属及亚属分类检索表明确其分类地位。共检视并解剖小绿叶蝉雄虫标本100余头,提取20余头DNA进行测序,得到16条709 bp大小的COⅠ基因序列片段,结合NCBI上相关的叶蝉COⅠ序列,建立基因进化树。综合分析其外部形态、雄性外生殖器特征以及COⅠ序列比对,明确了喜树丛枝植原体主要媒介昆虫是拟帕小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenis Zhanget Liu-CA,分类地位为小绿叶蝉属Empoasca Walsh, 1862,...     

云南蔓草虫豆丛枝植原体rp基因序列分析及结构预测

为了从亚组水平上明确云南元谋县的蔓草虫豆丛枝植原体的分类地位,本研究以rp(Ⅱ)F1/rp(Ⅱ)R1为引物,利用PCR对感病蔓草虫豆总DNA进行rp基因扩增.扩增产物进行序列分析和编码蛋白特性预测,并通过生物信息学软件对rp基因编码的rp122、rps3蛋白特性进行分析.结果 表明,PCR扩增测序得到1171 bp的特异性片段,该片段包括全部rpl22基因和大部分rps3基因,两基因相互重叠,分别编码128和237个氨基酸.通过同源性比对及系统进化树分析,从亚组水平明确了蔓草虫豆丛枝植原体是16SrⅡ-A亚组成员,且归属于rp-iii亚进化支.预测rp基因所编码的rp122和rps3蛋白均为脂溶性蛋白,且二级结构包括螺旋、卷曲和折叠.本研究结果可为深入研究蔓草虫豆丛枝植原体蛋白跨膜运输的分子机理提供一定的理论参考.     

三七病害研究进展

目的明确云南省澜沧县林下有机三七种植基地及育苗基地三七根结线虫病病原种类及来源,为该地区三七根结线虫病的防治奠定基础。方法采用系统调查法对澜沧县林下三七种植基地、育苗基地的三七及其周边相同生境下的杂草进行根结线虫病害发生情况调查和病原线虫种类鉴定。结果3个基地中大塘子三七育苗基地的根结线虫危害最严重,发病率高达66.82%;其次是林下基地,而哈果马育苗基地危害相对较轻。经收集鉴定,危害林下和育苗基地三七和杂草的病原根结线虫为北方根结线虫(Meloidogyne hapla);在思茅松林下分布杂草97种,其中发生根结线虫病的杂草有紫茎泽兰和积雪草2种,根据杂草的分布丰度和根结线虫寄生的程度可以判断紫茎泽兰是林下三七根结线虫病的主要中间寄主。两育苗基地的杂草类型基本一致,分布杂草124种,其中发生根结线虫病的杂草有溪黄草、紫茎泽兰、鬼针草、六棱菊、豆茶决明、野茼蒿、香薷、一点红、积雪草、草玉梅和豨莶等11种,根据杂草的分布丰度和根结线虫寄生的程度可以判断鬼针草、野茼蒿和紫茎泽兰是三七育苗基地三七根结线虫病的主要中间寄主。结论云南省澜沧县林下及育苗基地危害三七及杂草的病原线虫均为北方根结线虫(M. hapla),种苗带病是林下三七根结线虫病发生的主要原因,而苗圃地土壤中的病原线虫来自易感病杂草的富集作用。因此,三七育苗地的选择、育苗和移栽过程中杂草的清除是病害防控的关键。     

萝卜花变叶病病原鉴定及赤霉素合成与代谢途径中关键酶基因的表达

【目的】明确云南元谋地区发生的萝卜花变叶病病原以及赤霉素合成途径中关键酶基因表达量的变化。【方法】对自然表现花变叶、丛枝和节间缩短的萝卜感病植株总DNA进行植原体16S rRNA基因扩增、克隆、测序及系统进化树构建,并采用实时荧光定量PCR技术分析赤霉素合成及代谢途径中关键酶基因(GA20ox1、GA3ox1和GA2ox1)表达量的变化。【结果】该植原体株系与16SrⅡ-A亚组相似性最高(0.98),并与16SrⅡ-A亚组中的其他植原体株系明显形成一个进化支。【结论】萝卜花变叶植原体(Raphanus sativus phyllody,RsPh-YNym)为植原体16SrⅡ-A亚组成员,且与候选种Candidatus Phytoplasma aurantifolia相关,明确了该株系的分类地位;感病植株茎中3种关键酶基因GA20ox1、GA3ox1和GA2ox1表达水平发生了变化,表达量均下调,说明植原体的侵染造成了植株赤霉素稳态被破坏,从而导致植株表型改变。     

云南芝麻丛枝和花变叶植原体16S rRNA和rp基因序列分析

 本研究通过对表现出丛枝和花变叶症状的芝麻感病植株总DNA进行植原体16S rRNA和rp基因的PCR扩增、克隆、测序及序列分析,明确了两种病株的病原均为植原体,并将其命名为云南元谋芝麻丛枝植原体(SEWB-YNym)和云南元谋芝麻花变叶植原体(SEP-YNym)。两个株系的16S rRNA基因片段长度均为1 248 bp,并且碱基序列完全一致。通过与其他地区报道的芝麻植原体株系16S rRNA基因序列比对后发现这两个株系与来自缅甸的株系不存在位点差异,而与泰国、中国台湾、印度的株系分别存在3~6个位点差异。同时,还从两个株系中获得了长度均为1 171 bp并且碱基序列也完全一致的SEWB-YNym和SEP-YNym的rp基因序列。此rp基因序列包括全部rpl22基因(nt90-476)和部分rps3基因(nt550-1170),分别编码128和206个氨基酸。通过对16S rRNA和rp基因的序列进行同源性比对、构建系统进化树等分析,表明两个株系与候选种‘Candidatus Phytoplasma aurantifolia'相关,为16SrII-A亚组成员,并归属于植原体rp-iii亚进化支。     

野生豆科牧草种子发芽条件筛选与标准化的研究

\t\t\t\t\t目的\t\t\t\t\t为确定在云南元谋地区蔓草虫豆上发生的疑似丛枝病的病原种类。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t方法\t\t\t\t\t利用植原体16S rDNA基因及secY基因通用引物对蔓草虫豆感病植株总DNA进行直接PCR和巢式PCR扩增、克隆和测序,分别获得1.8 kb和1.7 kb 的16S rDNA、secY基因片段。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结果\t\t\t\t\t16S rDNA 片段iPhyClassifier在线虚拟RFLP及系统进化分析表明：蔓草虫豆丛枝植原体属于16SrII-A亚组成员(相似系数为1.00),与候选种Candidatus Phytoplasma australasiae相关。基于secY基因同源性比对及构建的系统进化树,表明该株系与来源于云南、台湾的花生丛枝植原体组各株系的亲缘关系最近,确定了该株系属于16SrII-A亚组成员。该分类结果与基于16S rDNA基因的分析结果一致。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结论\t\t\t\t\t本研究首次采用分子生物技术确定了云南元谋蔓草虫豆丛枝病的病原是植原体,明确了其分类地位,该结果可为该病害的早期诊断、检测提供理论依据。\t\t\t\t