喜树丛枝植原体的分子鉴定及TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

 为确定在云南文山地区喜树上发生的疑似丛枝病的病原种类及快速检测喜树丛枝病,本研究利用植原体16S rDNA基因通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2对感病喜树总DNA进行常规PCR和巢式PCR扩增、克隆和测序,通过系统进化分析,明确了喜树丛枝植原体属于16SrXXXII组。然后根据喜树丛枝病植原体16S rDNA基因保守区域设计并合成特异性引物和TaqMan探针,制备了喜树丛枝病植原体标准质粒,确定了最优引物浓度和最佳探针浓度,制作的标准曲线有极好的线性关系,决定系数(R²)达到0.999,建立的实时荧光定量PCR检测方法能够特异性地检测喜树丛枝植原体。本研究首次明确了喜树丛枝植原体的分类地位,优化和建立了喜树丛枝植原体TaqMan探针qPCR检测方法,为快速检测喜树丛枝病植原体提供参考。     

基于线粒体COⅠ基因及形态特征的喜树丛枝植原体主要媒介昆虫种类鉴定

植原体病害是喜树上危害最严重的病害之一,传播喜树植原体病害的主要媒介昆虫是喜树上的一种小绿叶蝉,为进一步分析媒介昆虫传播植原体机制以及植原体在昆虫体内的侵染循环过程,为植原体病害的科学防控提供参考,媒介昆虫的种类及分类地位必须先行明确。通过网捕法采集云南文山喜树上的小绿叶蝉标本,在体视显微镜下根据各龄期外部形态以及雄性外生殖器特征进行种类鉴定,结合PCR扩增线粒体COⅠ基因序列片段进行测序和比对,利用Kimura 2-parameter模型计算出平均遗传距离并用最大似然法构建系统发育树,进一步明确其分类地位,再根据前人制作的属及亚属分类检索表明确其分类地位。共检视并解剖小绿叶蝉雄虫标本100余头,提取20余头DNA进行测序,得到16条709 bp大小的COⅠ基因序列片段,结合NCBI上相关的叶蝉COⅠ序列,建立基因进化树。综合分析其外部形态、雄性外生殖器特征以及COⅠ序列比对,明确了喜树丛枝植原体主要媒介昆虫是拟帕小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenis Zhanget Liu-CA,分类地位为小绿叶蝉属Empoasca Walsh, 1862,...     

云南蔓草虫豆丛枝植原体rp基因序列分析及结构预测

为了从亚组水平上明确云南元谋县的蔓草虫豆丛枝植原体的分类地位,本研究以rp(Ⅱ)F1/rp(Ⅱ)R1为引物,利用PCR对感病蔓草虫豆总DNA进行rp基因扩增.扩增产物进行序列分析和编码蛋白特性预测,并通过生物信息学软件对rp基因编码的rp122、rps3蛋白特性进行分析.结果 表明,PCR扩增测序得到1171 bp的特异性片段,该片段包括全部rpl22基因和大部分rps3基因,两基因相互重叠,分别编码128和237个氨基酸.通过同源性比对及系统进化树分析,从亚组水平明确了蔓草虫豆丛枝植原体是16SrⅡ-A亚组成员,且归属于rp-iii亚进化支.预测rp基因所编码的rp122和rps3蛋白均为脂溶性蛋白,且二级结构包括螺旋、卷曲和折叠.本研究结果可为深入研究蔓草虫豆丛枝植原体蛋白跨膜运输的分子机理提供一定的理论参考.     

云南芝麻丛枝和花变叶植原体16S rRNA和rp基因序列分析

 本研究通过对表现出丛枝和花变叶症状的芝麻感病植株总DNA进行植原体16S rRNA和rp基因的PCR扩增、克隆、测序及序列分析,明确了两种病株的病原均为植原体,并将其命名为云南元谋芝麻丛枝植原体(SEWB-YNym)和云南元谋芝麻花变叶植原体(SEP-YNym)。两个株系的16S rRNA基因片段长度均为1 248 bp,并且碱基序列完全一致。通过与其他地区报道的芝麻植原体株系16S rRNA基因序列比对后发现这两个株系与来自缅甸的株系不存在位点差异,而与泰国、中国台湾、印度的株系分别存在3~6个位点差异。同时,还从两个株系中获得了长度均为1 171 bp并且碱基序列也完全一致的SEWB-YNym和SEP-YNym的rp基因序列。此rp基因序列包括全部rpl22基因(nt90-476)和部分rps3基因(nt550-1170),分别编码128和206个氨基酸。通过对16S rRNA和rp基因的序列进行同源性比对、构建系统进化树等分析,表明两个株系与候选种‘Candidatus Phytoplasma aurantifolia'相关,为16SrII-A亚组成员,并归属于植原体rp-iii亚进化支。