马立克病病毒分子生物学检测技术研究进展

马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)早期感染雏鸡引起的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病。MDV以水平传播为主,具有高度接触性和传染性、高致病率以及高致死率等特征,给全球养禽业造成巨大经济损失。该病主要依赖MD疫苗免疫预防,近50年来在MD疫苗广泛使用和持续免疫压力下,MDV毒力不断增强,部分毒株已突破现有商品疫苗的免疫保护。尽早对MD疑似病例进行快速准确的鉴别诊断,可为生产企业和养殖户及时采取措施、减少和挽回部分经济损失提供重要依据。经典的诊断方法已难以满足当下对MD病例快速诊断的需要。本文重点对近十年中新建立的分子生物学技术,如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、多重PCR及液相芯片等在MDV检测和MD诊断中的研究及应用进行了综述,以期为今后研究建立用于MD流行病学调查、临床病例早期诊断和流行毒株分型鉴定的鉴别诊断技术提供参考。     

抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及竞争ELISA试剂盒的研制

利用合成的完全抗原(BSA-ENR)免疫小鼠,通过细胞融合技术和间接竞争ELISA筛选出了能分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以此为基础研制恩诺沙星残留检测的竞争ELISA试剂盒(competitive ELISA ENR-Kit),并测定其性能。结果表明:筛选出的2株杂交瘤细胞,单抗亚类均为IgG1型,其中4G1-B3株的ENR mAb间接ELISA效价为1:1.024×106,亲和常数(Ka)为9×1010L/mol;竞争ELISA试剂盒的线性检测范围为0.05~101.6μg/L、灵敏度0.05μg/L、半数抑制浓度(IC50)1.1μg/L,与其他化合物的交叉反应率(CR%)均小于0.01%,鸡肉样、鸡肝样、鱼肉样和牛奶样的平均添加回收率分别为81.5%8、7.6%、84.3%和95%,不同基质添加恩诺沙星标准品做竞争ELISA对ENR-Kit检测结果影响小,试剂盒保存期6个月以上。结果说明该竞争ELISA试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点,适用于ENR残留的快速检测。     

马立克氏病病毒编码的miR-M12-5p对鸡HVCN1基因表达的靶向调控

为研究miR-M12-5p在马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染过程中的调控作用,利用生物信息学方法对其候选靶基因进行预测分析,发现4个miR-M12-5p的结合靶点。体外双荧光素酶报告试验结果表明,miR-M12-5p可结合宿主鸡的氢离子电压门控通道1(HVCN1)基因mRNA的3'-UTR相应位点并发生特异性相互作用。实时荧光定量PCR分析进一步证实,miR-M12-5p能够在体内下调HVCN1基因的表达水平。上述结果表明,miR-M12-5p可以靶向调控宿主基因HVCN1的表达。     

抗谷胱甘肽-S-转移酶(GST)单克隆抗体的研制及初步应用

以纯化的谷胱甘肽转移酶标签蛋白(GST)免疫Balb/C小鼠,取免疫鼠脾细胞与NSO骨髓瘤细胞按常规方法融合,用纯化的GST经间接ELISA筛选,阳性孔经3次有限稀释法亚克隆,最终获得2株抗GST的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为4B7-F4和4B7-F4.间接ELISA检测4B7-E4、4B7-F4细胞培养上清的效价分...     

恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性

将恩诺沙星(ENR)偶联于载体蛋白BSA,形成完全抗原(BSA-ENR)并免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术制备分泌抗恩诺沙星的杂交瘤细胞株,用体内诱生腹水法生产ENR单克隆抗体。结果筛选出4G1-B3,4G1-G1和4G1-B9 3株敏感特异的杂交瘤。3株单抗对ENR的半数抑制浓度(IC50)分别为1.04 ng/mL,2.44 ng/mL,4.24 ng/mL。4G1-B3与环丙沙星有0.02%的交叉反应,与其他竞争物的交叉反应率均小于0.01%;4G1-G1和4G1-B9与其他竞争物的交叉反应率均小于0.01%。     

猪乙脑病毒河南分离株CSF.ZMD-3的分离鉴定及分子进化分析

采集河南省规模化猪场流产母猪死胎脑脊液作为样本,通过细胞盲传培养分离乙型脑炎病毒流行毒株,对新分离的病毒进行分子生物学鉴定,获得1株分离株并命名为CSF.ZMD-3。DNA序列测定及比对分析该分离株与已报道毒株基因的序列同源性,确定该分离毒株为乙脑病毒。使用MEGA3.1软件对CSF.ZMD-3毒株主要结构蛋白E蛋白的基因序列进行分子进化分析,确定CSF.ZMD-3为基因Ⅲ型乙脑病毒。     

MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失BAC克隆株的构建及其体外增殖特性

为构建缺失马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)Meq基因簇microRNAs(Meq-clustered miRNAs的突变株,本研究在vv MDV GX0101细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)克隆的基础上,采用Red/ET同源重组技术将Meq-clustered miRNAs的编码基因进行缺失突变,经PCR鉴定及序列分析证明Meq-cluster miRNAs序列成功缺失后,提取Δmeq-miRNAs BAC DNA,转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒拯救,用SYBR GreenⅠqRT-PCR检测病毒体外增殖特性。结果表明成功拯救出缺失MDV Meq-clustered miRNAs基因的感染性BAC克隆株GX0101Δmeq-miRNAs,且该缺失株与亲本株GX0101BAC具有相似的增殖曲线,Meq-clustered miRNAs是MDV体外复制的非必需基因。MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失感染性BAC克隆株的成功构建为进一步研究MDV Meq-clustered miRNAs在MDV致病和致肿瘤方面的作用奠定了基础。     

商品肉鸡暴发大肠杆菌病的诊断报告

20 0 1年元月 ,河南省博爱县某养殖户的一批肉鸡暴发急性传染病 ,经临床及实验室检查 ,确诊为大肠杆菌感染 ,现报告如下。1　发病情况2 0 0 1年元月中旬该养殖户饲养的 30 0 0只32日龄商品ＡＡ肉鸡突然发病 ,4天内死亡 2 0 0余只 ,病鸡表现精神沉郁 ,缩颈闭目 ,羽毛蓬松 ,食欲、饮欲均下降 ,排黄白色、黄绿色稀粪 ,用氧氟沙星治疗无效。2　实验室检查剖检变化 :病死鸡有心包炎、肝周炎、腹膜炎 ,其中少数有腹水 ,腺胃乳头有脓性分泌物 ,气管粘膜轻微充血。镜检变化 :将肝、脾触片进行革兰氏染色后镜检 ,看到有较多细小的革兰氏阴性短杆状细…     

猪乙脑病毒分离株CSF.XZ2D在BHK21细胞上的传代培养及E基因序列分析

为了解河南省规模化猪场日本乙型脑炎病毒(JEV)流行株的特征及其遗传基因的稳定性,将猪乙脑病毒分离株CSF.XZ-2D在BHK-21细胞上进行连续传代培养,并对其E基因的遗传稳定性进行了研究。结果表明,经连续传代25次后病毒E基因趋于稳定,氨基酸位点E271(E→V)和E278(V→L)传代后发生稳定点突变。与JEV毒力相关的部分位点如E107、E138、E176、E177和E315遗传稳定性较高,经连续传代后均未发生突变,与SA14-14-2相应位点完全一致。但是,另外一些位点的遗传稳定性较差,如E279和E312分别出现K→M→K和K→R→K→R的反复突变。这些突变是否与JEV的宿主细胞适应性及毒力变化相关有待进一步研究。