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为了制备高灵敏度、高特异性的抗新霉素单链抗体,试验采用从杂交瘤细胞中提取单链抗体基因,转入大肠杆菌表达系统进行表达。然后采用分子对接的方法研究抗新霉素单链抗体和新霉素分子的识别机制并进行虚拟突变,将关键结合位点的氨基酸残基进行突变,在对突变体进行表达和纯化后建立间接竞争酶联免疫吸附分析方法。结果表明:氨基酸残基Leu227为单链抗体与新霉素结合的关键氨基酸残基,将其突变为Asp,获得突变体。IC50为1.58 ng/mL,相比于亲本单链抗体的26.23 ng/mL,突变体的敏感性提高了16.6倍。试验成功制备了高灵敏度、高特异性的抗新霉素单链抗体,为动物源性食品中的抗生素残留检测提供了研究基础。 相似文献
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为研究猪源乙脑病毒分离株基因遗传稳定性,对猪源乙脑病毒分离株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21细胞上连续传代60次后的病毒全基因组进行序列测定及分析。结果表明,BSF.ZZ-1-p60、BSF.ZZ-3-p60基因组全长均与各自的亲本毒株BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3一致,均为10 977 nt,在2个病毒基因组的10 701 nt位点处均插入1个碱基G。与亲本毒株相比,2个细胞传代毒株的病毒基因组经连续传代后趋于稳定,均有10个位点发生氨基酸突变,这些突变主要集中在E蛋白区域。核苷酸序列同源性比对分析发现,与其他JEV参考毒株相比,BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60与弱毒疫苗株SA14-14-2的核苷酸序列同源性较高,分别为99.6%和95.9%,其氨基酸序列与猪源野毒分离株SH0601和HW的氨基酸序列同源性较高,分别为98.2%、86.4%和98.3%、86.5%。 相似文献
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O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定 总被引:3,自引:0,他引:3
为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础. 相似文献
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乙型脑炎病毒感染小鼠原代神经元细胞的miRNA表达谱差异分析 总被引:1,自引:1,他引:0
研究乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染后小鼠原代神经元细胞miRNA的表达谱差异,初步探讨JEV与宿主在miRNA水平的相互作用。分别提取JEV感染48 h后的小鼠原代神经元细胞和未染毒组细胞,高通量测序分析miRNA的表达谱并进行差异分析,选取显著差异表达的miRNA进行实时定量PCR验证。结果筛选出26个差异表达显著的miRNA,其中,18个表达上调,8个表达下调。小鼠原代脑神经元细胞中mmu-miR-21a-3p、mmu-miR-223-5p、mmu-miR-147-3p、mmu-miR-155-5p和mmu-miR-146a-5p的表达促进JEV-E基因在神经元细胞中表达,而mmu-miR-301a的表达抑制JEV-E基因的表达。神经元细胞中miRNA的表达影响JEV的复制,为进一步研究JEV致神经功能异常机制提供研究方向和理论支持。 相似文献
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作者以固相法合成特异性FMDV主要保护性抗原VP1上的表位肽,将其与载体蛋白BSA偶联,作为包被抗原,制备检测抗O型口蹄疫病毒(FMDV)抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核.结果表明该方法的敏感性为95.12%,特异性为100%.检测199份血清标本,与UBI FMD VP1试剂盒的符合率达到98.49%,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达到96.98%.该多肽ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控口蹄疫抗体水平. 相似文献
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本研究利用RT-PCR技术,从鸡法氏囊淋巴瘤细胞系DT40中扩增slgMλ轻链基因并在E.coli中进行了表达。序列分析结果表明,sIgMλ轻链基因全长852nt,含有一个长度为657nt的ORF及长度为195nt的3′-UTR,该基因与鸡Igλ基因的序列同源性为95%,差异位点主要存在于λ轻链的可变区。氨基酸序列预测结果表明,DT40sIgMλ蛋白与鸡Igλ蛋白的序列同源性为92.6%。构建的原核表达载体pET-λ在E.coli BL21(DE3)中成功的获得大量表达。本实验为进一步研究sIgM在IBDV感染法氏囊B淋巴细胞中的作用奠定了基础。 相似文献
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镰刀菌诱导后苦瓜幼叶cDNA文库的构建和鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
以白粉病菌侵染的苦瓜幼叶为材料,以λTrip IEx 2为载体,利用SMART技术构建了1个由镰刀菌病原诱导后的苦瓜幼叶cDNA文库.结果显示,初始文库的滴度为4.0×106pfu.mL-1,扩增后滴度为8.1×109pfu.mL-1,插入片段大小分布在500~3 000 bp,平均值大于1 000 bp,重组效率为98%. 相似文献
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为探究病毒编码的微小RNA前体基因miR-M11对马立克病病毒(MDV)体外复制能力的影响,以MDV国内分离株HN302为研究对象,利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑并敲除位于Mid基因簇的miRM11,构建1株miR-M11基因编辑缺失毒株HN302ΔM11(克隆号C58-8-4)。经过PCR鉴定、测序分析、间接免疫荧光试验(IFA)、实时荧光定量PCR(qPCR)以及传代稳定性分析,证实HN302编码的miRM11被精确编辑并从病毒基因组中完全缺失,且未发生回复突变。病毒增殖曲线绘制结果显示,miRM11缺失毒株HN302ΔM11的增殖速度显著高于亲本毒株HN302(P<0.05)。综上,miR-M11是MDV复制的非必需基因,且其缺失后可增强MDV的体外复制能力。 相似文献