适用于蛋白质组分析的粉红单端孢菌蛋白提取方法的建立

为了优化一种适用于粉红单端孢菌双向电泳的蛋白质提取方法,以期为蛋白质组学水平研究粉红单端孢菌的致病机制奠定基础。以分离纯化后的粉红单端孢菌为试验材料,分别采用超声-TCA-丙酮、超声-磷酸-TCA-丙酮、超声-SDS、超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提和TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提等5种方法提取菌体蛋白质,通过对比分析蛋白质含量以及纯度筛选出2种较好的提取方法。在筛选聚丙烯酰胺电泳凝胶浓度的基础上,再通过双向电泳对比分析,得出最佳的蛋白质提取方法。结果表明,12%的聚丙烯酰胺凝胶浓度获得的单向电泳图谱背景清晰且无严重的拖尾现象,超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提法获得蛋白样品的质量浓度和含量分别为6.650 mg/mL和2.993 mg/g,该法提取蛋白通过SDS-PAGE分析条带清晰,双向电泳分析可获得1 238个独立清晰的蛋白点。由此可知,超声-TCA/丙酮-酚/SDS联合抽提法获得的粉红单端孢菌体蛋白适合于双向电泳分析及蛋白质组学研究。     

适用于双向电泳分析的链格孢菌体蛋白提取方法的筛选

为筛选出一套适用于双向电泳分析的链格孢菌蛋白的提取方法,以该菌为研究材料,首先采用TCA-丙酮法、磷酸-TCA-丙酮法、SDS提取法和TCA/丙酮-SDS/酚抽提法分别提取菌丝蛋白质,然后进行蛋白质浓度的测定和单向SDS-PAGE试验,并建立双向电泳体系。结果表明:TCA/丙酮-SDS/酚抽提法所获得的蛋白质浓度为15.9 mg/mL,分别是其他三种方法所得蛋白浓度的2.64、4.61和1.43倍;SDS-PAGE图谱中形成的条带数目最多、丰度最好;所获得的2-DE图谱背景清晰干净,无明显的横纵条纹,分辨率高,可辨别的蛋白质点数为1 138个,是TCA-丙酮法所分离蛋白点数的1.89倍。由此可知,TCA/丙酮-SDS/酚抽提法为链格孢菌蛋白提取的最优方法,该方法所提取的蛋白质适用于双向电泳分析及后续的蛋白质组学研究。