抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性定量PCR检测方法的建立及其标准化

【目的】抗逆大豆IND-??41?-5已获得中国进口加工原料安全证书,建立一种特异、准确、灵敏的抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,为抗逆大豆IND-??41?-5在中国的安全监管提供精准测量技术。【方法】首先利用Beacon designer 8.0软件对抗逆大豆IND-??41?-5转化体5′端旁侧序列设计18对引物探针,结合1对罗萨里奥农业生物技术学院公司提供的引物探针,随后采用qPCR技术对引物探针进行特异性筛选,遴选出1对候选引物探针;设置实时荧光定量PCR的引物/探针浓度梯度,优化qPCR方法的反应体系;设置不同类型的特异性测试样品测试方法的特异性;以纯合抗逆大豆IND-??41?-5基因组DNA作为标准样品,梯度稀释成标准溶液模板,绘制标准曲线,考察qPCR方法的线性动态范围,配置拷贝数比值为5%、1%和0.1%的测试样品,评价定量方法的准确性;配置拷贝数比值为0.05%和0.025%的样品,测试方法的检出限;拷贝数比值为0.1%的样品经16次定量测试,确定方法的定量限;最终确定抗逆大豆IND-??41?-5转化体特异性实时荧...     

《油料作物育种学》中文版由科学出版社出版发行

由J.Vollman和I.Rajcan编著的《油料作物育种学》中文版于2012年3月由科学出版社出版发行。该书共421页,约62.4万字,定价98元。油料作物多样性极高,既有生育期很短的一年生草本植物,也有寿命达2000多年的多年生木本植物,既有自花授粉植物,也有异花授粉植物,还有无性繁殖植物。因此,要编写一本油料作物育种学著作是一件非常具有挑战性的事情,我国迄今还没有此类著作问世,国际上也十分少见     

主要农作物转基因飘流频率和距离的数据调研与分析Ⅴ.油菜

转基因植物在批准商业化之前通常要求在控制条件下开展实验。我国规定转基因油菜田间试验的隔离距离为1 000 m,该距离大于世界上绝大多数国家和地区的规定。转基因油菜基因流研究的数据显示,自然条件下甘蓝型油菜品种间的天然异交率一般不超过3%,多数在1%以下,隔离距离和保护行可以显著降低异交率,隔离距离400 m处异交率低于0.01%。白菜型油菜、自交不亲和系和雄性不育系的异交率则要高得多。建议对转基因油菜的安全监管采取分类管理和阈值管理的原则,在0.1%允许阈值下,普通甘蓝型油菜的隔离距离可设为400 m,而以异花授粉为主的其他油菜（包括白菜型油菜与其他类型油菜的自交不亲和系和雄性不育系）的隔离距离可设为1 000 m。     

转基因大豆CP4-EPSPS蛋白的降解规律研究

随着转基因技术发展和应用,转基因外源基因表达蛋白在环境中富集和降解情况成为公众关注的问题,外源蛋白在环境中的检测和监测成为转基因研究和监管的一个方向.本研究利用模拟自然降解和蛋白酶K两种方式,处理转基因大豆种子(5％GTS 40-3-2),采用Western blot、双抗夹心快速检测试纸条和酶联免疫吸附测定(ELIS...     

基于便携式生物传感器设备的转基因现场快速分析研究

现场快速检验(point of care test,POCT)是实现转基因基层监管必要的技术手段,在转基因成分检测中发挥着重要作用.生物传感器为转基因成分简单、快速和低成本定量分析提供了一个可行的技术方案.目前大量的生物传感器研究还处于方法学研究阶段,研究者需要着重将生物传感器技术与分析设备集成,开发小型化的便携式检测...     

抗虫耐除草剂玉米瑞丰125 RPA快速检测方法的建立

瑞丰125为农业农村部首批获得生产应用农业转基因生物安全证书的抗虫耐除草剂转基因玉米之一。为给监管转基因生物安全提供支撑,利用重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）技术,针对瑞丰125的转化体插入位点序列设计了引物并进行筛选,对反应的温度、时间和引物浓度进行了优化。结果显示,RPA体系在30～45℃范围内,20 min即可有效扩增,比PCR检测时间大大缩短。引物浓度会影响RPA的扩增效率,引物终浓度为0.35μmol/L时扩增效果最好。同时对RPA检测方法的特异性、灵敏度等进行考察,结果表明该检测方法的特异性良好,检测灵敏度可达到36拷贝。该恒温快速的检测方法为瑞丰125的快速检测提供依据,为商业化转基因作物的监管提供支撑,有望用于转基因成分的现场快速检测。     

一种基因编辑位点特异性PCR方法的开发和应用

为了对基因组编辑产品进行精准定性和定量检测,以水稻SP1 基因的编辑植株为材料,在编辑位点上下游设计通用引物,在编辑位点处设计基因编辑位点特异性TaqMan探针,建立了编辑位点特异性PCR方法。利用该方法可准确鉴定特异基因组编辑产品,检测灵敏度达到5~10拷贝,可在实时荧光PCR（qPCR）和微滴数字PCR（ddPCR）平台上对基因组编辑产品进行定量检测。由于数字PCR的微反应单元可消除野生型DNA对通用引物的竞争性消耗,与qPCR的定量结果相比,ddPCR定量结果具有更高的定量准确性。     

转基因玉米MON87427/zSSIIb 二重微滴数字PCR方法建立及应用

实施转基因产品定量标识制度需要建立准确可靠的定量检测技术和方法。数字PCR（dPCR）不依赖标准物质,实现对DNA分子的绝对定量,已成功用于转基因含量检测和标准物质定值。为建立可靠的dPCR方法,获得准确测量结果,本研究以耐除草剂玉米MON87427为材料,探索建立二重微滴数字PCR（ddPCR）的策略。以构建的聚合MON87427转化体和5个玉米内标基因的重组质粒pUC57-M为质控样品,将5个不同的玉米内标基因分别与MON87427组合,通过优化退火温度,根据阳性微滴与阴性微滴分辨率、中等信号强度雨滴数量及测量值与理论值的一致性等,确定了二重ddPCR组合为MON87427/zSSIIb,最适退火温度为58.4℃。MON87427/zSSIIb 二重ddPCR的动力学范围为10～60 000拷贝。对盲样进行定量检测,二重ddPCR的定量结果与荧光定量PCR有良好的可比性,表明MON87427/zSSIIb 二重ddPCR可取代qPCR方法进行转基因玉米MON87427的定量检测及标准物质定值。     

一株对鳞翅目蔬菜害虫具有广谱高毒力的新Bt菌株

从河北省土壤分离出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）MB-15菌株,利用室内生物活性测定的方法,与Bt标准菌株HD-1的杀虫毒力进行比较,结果发现该菌株胞晶混合液对棉铃虫(Helicoverpa armigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、小菜蛾(Plutella xylostella)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)和菜青虫(Pieris rapae)等5种鳞翅目蔬菜害虫的毒力均高于标准菌株Bt HD-1胞晶混合液。对发酵液各组分活性的分析发现,该菌株的上清液对胞晶混合物的杀虫活性有明显的增效作用。光学显微镜下观察该菌株伴胞晶体为菱形,SDS-PAGE分析显示其伴胞晶体主要由130.0 kDa和65.0 kDa 两种晶体蛋白组成。利用PCR-RFLP对其杀虫基因型进行鉴定,结果表明该菌株含有cry1Ac、cry2Aa、cry1I和vip3Aa基因。推断该菌株是一株对鳞翅目蔬菜害虫的防治具有潜在的商业开发价值的Bt野生株。     

转基因玉米NK603转化体/zSSIIb内标基因二重微滴数字PCR方法的建立及应用

【目的】批准进口的转基因玉米NK603是中国转基因生物安全监管的主要对象。转基因安全监管需要标准物质和标准检测方法,建立转基因玉米NK603的数字PCR(dPCR)方法将为转基因玉米NK603的定量检测和标准物质研制提供精准测量技术。【方法】采用人工合成技术构建标准质粒分子pUC57-NK603;将NK603转化体与不同的玉米内标基因引物/探针一一组合,遴选与NK603转化体特异性PCR具有相同扩增能力的玉米内标基因PCR方法;设置二重微滴数字PCR(ddPCR)的退火温度梯度和引物/探针浓度梯度,优化二重ddPCR的反应体系和反应条件;用梯度稀释的标准质粒溶液作模板,考察二重ddPCR的检测极限、定量极限和动力学范围;将转基因玉米NK603种子粉末和非转基因玉米种子粉末混合,配制质量分数分别为100%、10%和6%的盲样,考察二重ddPCR的定量准确性。【结果】用标准质粒分子pUC57-NK603作为二重ddPCR的质控对照,通过考察二重ddPCR反应热图的微滴信号强度、阳性微滴与阴性微滴分辨率、雨滴数量、NK603转化体与内标基因拷贝数比值测量值与预期值的一致性,确定将NK603转...