植物Dicer-like功能的研究进展

Dicer是一种核酸内切酶,是RNA酶Ⅲ (RNase Ⅲ)家族成员之一。植物中Dicer的同源蛋白称为Dicer-like (DCL)。通常情况下,Dicer蛋白由DEAD box、RNA解旋酶结构域、DUF283、PAZ、RNaseⅢ和双链RNA结合结构域(dsRNA binding domain, dsRBD) 6部分组成,各个结构域之间紧密联系,共同作用。为了进一步深化对植物中DCL功能的认识,本研究归纳了DCL的蛋白结构域、DCL在小RNA生成中的剪切作用以及几种模式植物中DCL的生化作用,提出了不同类型的DCL在小RNA合成机制中相对独立又密切联系的作用。DCL识别何种RNA底物以及对底物剪切位置的确定,将会成为研究Dicer生化功能的重点内容。     

磁珠和蛋白质标签特异性免疫沉淀体系的建立

为建立植物中特异性免疫沉淀微量蛋白体系,以GUS为报告基因,利用Flag、Myc两种蛋白标签对GUS氨基端进行标记,以农杆菌为介导,在烟草叶片中瞬时高效表达GUS基因。利用Western blot检测叶片中标记的GUS蛋白含量,便于后续GUS蛋白的特异性纯化。以anti-Flag M2磁珠和anti-c-Myc琼脂糖为固相载体,特异性识别和结合标记的GUS蛋白,利用磁分离技术和特异性免疫沉淀对目的蛋白进行两次富集,通过Western blot检测对比各个步骤所得目的蛋白的含量判断富集纯化效果。结果表明,以磁珠和琼脂糖为载体的蛋白,经两次特异性免疫沉淀后得到明显富集和纯化,且每一次的富集效果都较好,初步建立了蛋白标签和磁珠法二次特异性免疫沉淀体系,为体外深入研究活性蛋白复合体奠定了一定的技术基础。