马蔺DFR基因的克隆及生物信息学特征分析

以马蔺花瓣为试材,通过转录组测序,应用PCR技术克隆马蔺花青素生物合成关键酶二羟黄酮醇-4-还原酶(dihydvroflavonol-4-reductase,DFR)基因并获得其生物信息学特征。结果表明:马蔺DFR基因全长1 427bp,共编码357个氨基酸(该基因命名为IlDFR,GenBank登录号为KY907171)。该基因在氨基酸水平上与多种植物的DFR具有较高的同源性,在系统进化上与同属的荷兰鸢尾(Iris hollandica)的DFR亲缘关系较近;预测其蛋白质相对分子质量为39.99kDa,等电点为5.89,主要由α-螺旋和β-折叠构成,定位于细胞质,属于酸性亲水不含信号肽的不稳定类蛋白质。马蔺IlDFR有一段氨基酸序列‘VTGASGYVGSWLVMKLLRDGY’与大部分物种的DFR特有相对保守的NADPH结合域非常相似,只有4个氨基酸残基有所差异。     

用于植物多基因表达载体构建的质粒系统

为克服目前常用于植物基因表达载体构建的质粒由于酶切位点有限,目的基因片段难于插入,缺少植物基因表达所必须的启动子、终止子和筛选标记等功能元件,无法构建多个基因表达载体等缺点,本研究通过对大肠杆菌(Escherichia coli)质粒p UC18和双核农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti(tumer inducing)质粒p BI121进行改造,建立了一套适用于植物基因表达载体构建的质粒系统,即重组质粒p KAFCR80和p KAFCR100。p KAFCR80具有植物基因表达最常用的CAMV 35S启动子(cauliflower mosaic virus 35S promoter)和NOS终止子(Nopaline synthase terminator),并在其上游、中间和下游引入了多个克隆酶切位点,利用PCR等方法克隆得到的目的基因片段可以多种方式连接到35S启动子与NOS终止子之间;p KAFCR100具有卡那霉素NPTⅡ(neomycin phosphotransferaseⅡ)耐性基因和s GFP(synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)绿色荧光蛋白报告基因,以及其中间的多克隆酶切位点。p KAFCR80与p KAFCR100两个质粒的配合使用,可以方便地构建植物单个或多个基因表达载体。本研究以PCR扩增的甜叶菊葡萄糖基转移酶三个基因为材料,利用该质粒系统以单独和组合形式成功地构建了植物表达载体,验证了该系统的实用性。