甜菜SCoT-PCR反应体系的建立及优化

旨在利用SCoT分子标记技术为甜菜指纹图谱构建、遗传多样性分析以及其他分子标记辅助育种提供技术支持。本研究利用单因素实验优化了甜菜SCoT-PCR反应体系。结果表明,在20 μL反应体系中,甜菜SCoT-PCR最优反应体系包含2.0 μL的10×PCR buffer（含Mg² ）、10 ng的DNA、0.5 U的Taq DNA聚合酶、10 μmol/L的引物2 μL以及0.1 μL的dNTPs (2.5 mmol/L each)。利用优化后的程序对12份糖甜菜品种进行扩增,结果表明,该体系扩增结果稳定、条带清晰,可用于甜菜品种指纹图谱的构建以及其他分子生物学领域的研究。     

不同检测方法对甜菜ISSR引物多态性的影响

为了探讨不同检测方法对甜菜ISSR引物扩增效果的影响以及各方法的优缺点,笔者应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳两种检测方法对甜菜ISSR 引物扩增效果进行了检测。利用12个不同的甜菜品种,对10 个ISSR引物进行扩增,分别采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、1%的琼脂糖凝胶电泳以及2%的琼脂糖凝胶电泳对ISSR-PCR的扩增产物进行分离。结果表明：6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳无论是检测的总条带数还是多态性条带数均远高于琼脂糖凝胶电泳,且条带清晰,易于识别,而2%的琼脂糖凝胶电泳检测的条带数高于或等于1%的琼脂糖凝胶电泳,且条带更易于识别,因此,对于利用ISSR 引物进行QTL定位、指纹图谱构建以及遗传多样性分析时,推荐使用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,而对于种子纯度鉴定以及需要对ISSR扩增产物进行测序,则推荐使用2%的琼脂糖凝胶电泳。     

核酸染料Gelred在两种凝胶检测系统中的应用研究

由于无毒的核酸染料Gelred价格比较昂贵,在不影响实验效果的情况下,探讨Gelred在聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳中的最小用量。笔者将10000×的核酸染料Gelred稀释成1×、10×、20×、30×、40×、50×,将稀释后的核酸染料直接加入到甜菜PCR产物中。将核酸染料和甜菜PCR产物的混合物直接点样聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶,电泳后直接利用凝胶成像系统进行检测。以及另外一种方法是利用1×的Gelred分别对聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶进行泡胶,用凝胶成像系统进行检测。结果表明,Gelred 30×及以上的稀释浓度均适合于聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶,而1×的Gelred稀释液更适合于对聚丙烯酰胺凝胶进行泡胶。将稀释后的Gelred直接和PCR产物混合后,配合聚丙烯酰胺凝胶电泳,不仅减少了Gelred的使用量,而且减少了显影的时间。