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【目的】筛选稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系(DF-1),并基于单链退火修复机制(Single Strand Annealing, SSA)的报告载体系统,检测 DF-1 细胞系中的 Cas9 核酸酶活性。【方法】将携带 Cas9 蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染 293T 细胞包装慢病毒,收集慢病毒 Cas9 上清液感染 DF-1 细胞,经抗生素筛选得到稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,分别用 PCR 和 Western blot 验证阳性 DF-1 细胞表达 Cas9 蛋白的情况;选择鸡卵清白蛋白(OVA)基因的 sgRNA 序列,将 sgRNA 退火产物克隆至 pYP152 构建 sgRNA 表达载体,并在 sgRNA 靶位点两端设计引物扩增 OVA 基因靶片段,将靶片段克隆至报告载体 pCMV-SSA-mCherry-Hind Ⅲ,以破坏 mCherry 蛋白的表达,之后再将 sgRNA 表达载体与 SSA 报告载体共同转染稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对 mCherry 蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到 27 株稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,采用 PCR 扩增稳转细胞基因组,结果显示这些细胞具有 Cas9 蛋白基因序列,Western blots 试验结果显示上述稳转细胞株均表达 Cas9 蛋白;sgRNA 表达载体与 mCherry-SSA 报告载体共转后,通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中 mCherry 蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,可为后续在稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。 相似文献
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本试验研究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对鸡外周血T淋巴细胞迁移的影响,为探讨鸡对NDV免疫应答机制提供理论支撑.采用Transwell共培养,上室为淋巴细胞,下室为树突状细胞(Dendritic cells,DC),通过NDV攻毒刺激后,分别在第0、2、4、6 h收集各个时间点上... 相似文献
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植物病原效应蛋白功能研究方法 总被引:1,自引:0,他引:1
植株病原会分泌一些与植物相互作用的效应蛋白,这些蛋白在病原菌与寄主植物互作过程中起着重要作用。结合几种细菌、真菌分泌的效应蛋白研究进展,介绍了用于病原菌效应蛋白研究的试验方法及其独特之处,包括图位克隆、异源表达分析等,提出研究一个单一效应蛋白需要多种分析方法。 相似文献
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基因编辑是利用核酸酶在基因组的特定位点产生DNA双链断裂,从而触发细胞自身的DNA损伤修复机制,实现对靶基因序列进行位点特异性修饰。规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspersed short palindromic repeat,CRISPR)及其相关蛋白9(Cas9)系统作为第3代基因编辑技术在农业和基因治疗研究中发挥着重要作用,与传统的锌指核酶和转录激活因子样效应物核酶基因编辑方法相比,它可以靶向基因的任何位点引起DNA双链断裂,实现目标基因的精准敲除或插入外源片段,并能快速、高效地修饰基因组,包括基因敲除、敲入、抑制、激活等,是应用最广泛的基因编辑工具。CRISPR/Cas9技术的出现彻底改变了生命科学、医学和遗传学研究现状。近年来,利用CRISPR/Cas9技术对动物基因组进行修饰,开启了畜禽分子育种的新纪元,不仅极大地推动了现代畜禽养殖技术的发展,而且为人类医学研究做出了特殊贡献,特别是在猪和鸡上。作者以猪和鸡为对象,综述了CRISPR/Cas9技术在异体器官移植供体、人类疾病的生物模型、抗病育种材料、全基因组高通量筛选等方面的研究进展,以及如何利用CRISPR技术快速又简单地生产出基因编辑猪、鸡,为推动CRISPR技术制备其他基因编辑动物提供参考依据。 相似文献
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农业补贴是国家财政对本国农业支持和保护常用的政策工具,我国近几年加大了国家支持和保护农业的力度,但是我国农业补贴法制严重匮乏,不适应我国目前经济发展的需要.WTO框架下的农业补贴规则是各国农业补贴制度的依据,我国应依据WTO相关规定,构建适合我国农业补贴制度. 相似文献
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