Cry1Ac毒素突变体的构建、表达及杀虫活性测定

为了构建对敏感和类钙粘蛋白突变的抗性昆虫都具有高杀虫活性的毒素,将Cry1Ac毒素结构域I中α1和α2之间插入一个α胰凝乳蛋白酶作用位点,并分析突变体毒素在苏云金芽孢杆菌中形成伴孢晶体、目标蛋白的表达情况,以及鉴定突变体毒素的杀虫活性。结果发现:4个突变体蛋白都能在苏云金芽孢杆菌中表达产生约130 k Da的目标蛋白,但不能形成有规则的伴孢晶体。这可能是由于突变体蛋白在Bt生长的平稳期达到最高,在衰亡期开始被降解造成的。4个突变体中,Cry1Acm4在培养48 h时产量最高,而且其对甜菜夜蛾杀虫活性比野生型高1.6倍,但是其产量只有野生型毒素产量的十分之一。尽管由于Cry1Acm4的表达量较低而使其实际应用的价值不大,但这种构建突变体的方法对研究高毒力的Cry1Ac毒素提供一种新的思路。     

苏云金芽孢杆菌Vip3Aa10毒素结合肽的筛选及活性测定

【目的】Vip3A是由苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在对数生长期产生并分泌到胞外的对鳞翅目昆虫有较广杀虫谱的毒素,其在敏感昆虫中肠上的结合受体尚未得到鉴定。利用噬菌体展示技术,论文试图从肽库中筛选到能与Vip3A毒素特异性结合的多肽,为研究Vip3A毒素的杀虫模式提供线索。【方法】将构建的pET28a-Vip3Aa10表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达后,用亲和纯化的方法制备Vip3Aa10,并用胰蛋白酶活化和离子交换层析进一步纯化。以活化的Vip3Aa10毒素为诱饵,经“吸附-洗脱-扩繁”4轮条件逐渐严格的淘选,从噬菌体随机肽库中筛选能特异性地与活化的Vip3Aa10结合的噬菌体。以筛选到的噬菌体基因组DNA为模板,经PCR扩增和测序,获得插入到噬菌体上的外源基因的序列,并推导出相应多肽的氨基酸序列。将化学合成的多肽与活化的Vip3Aa10一起与甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)刷状缘膜囊泡共育后,用免疫印迹方法检测多肽对活化的Vip3Aa10与BBMV结合的影响。将合成的多肽与活化的Vip3Aa10一起涂布在饲料表面,晾干后,每孔放1只1龄的甜菜夜蛾幼虫。6 d后统计昆虫死亡情况。【结果】在25℃条件下用IPTG诱导含pET28a-Vip3Aa10质粒的大肠杆菌BL21（DE3）可以表达出可溶性的Vip3Aa10蛋白。经亲和纯化、胰蛋白酶活化以及离子交换层析后,可得到较纯的活化的Vip3Aa10。以活化的Vip3Aa10为诱饵,经过4轮条件逐渐严格的淘选,从十二肽库中筛选出9条多肽,其中3条多肽的丰度较高,分别命名为P12-1、P12-2和P12-3,从七肽库中筛选出5条多肽,其中1条多肽的丰度较高,命名为P7-1。结合试验和杀虫活性测定试验结果表明,P12-2和P7-1多肽能不同程度地抑制Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡的结合,以及抑制Vip3Aa10的杀虫活性。【结论】用噬菌体展示技术筛选的多肽P7-1能显著性地抑制Vip3Aa10与刷状缘膜囊泡的结合,可降低35%以上的Vip3Aa10的杀虫活性。