绞股蓝RIP基因双子叶植物表达载体的构建及其对烟草叶盘的转化

将绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)核糖体失活蛋白(Ribosome-Inactivating Protein,RIP)cDNA序列(GenBank登录号AY279219)插入到pKYLX71:35 S^2植物表达载体的HindⅢ/SacI位点处,构建了适于在双子叶植物中表达的载体,并经三亲交配法转入土壤农杆菌LBA4404,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录。     

绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值,以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值.它是一种多活性的物质,不同RIP具有各自独特的功能,其潜在活性还在不断发现之中.葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源,其中蕴涵着极其多样的RIP,但多数已知的RIP其基因尚未被克隆,而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法.葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效,其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道,但其活性蛋白成分未见报道.为此,本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究.率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究,从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白,Gynostemmin).它具有很高的抗TMV活性.其分子量约为27 kDa.测得其N-端19个氨基酸序列:DINFSLAGADGQTYNTFIA,与其它植物RIP的同源性为10%-73%,与葫芦科RIP的同源性为37%-73%.根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LY1/LY2,对基因组DNA进行PCR扩增,首次建立了RIP新基因快速筛选体系.从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因,长度为408 bp,编码136 aa,与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35%-85%.比较发现,19个葫芦科RIP的LY1/LY2区段上完全相同的氨基酸有29个,其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守,包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192.根据LY1/LY2区段同源性构建的系统进化树表明,葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致.通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆,从绞股蓝中分离了13个RIP基因,其中10个为cDNA序列,3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001).它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高,可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组:组1,发生6 bp缺失(535 GAAAAC 540,与574-579间的序列完全一样),包括GynostemminII、GP609和CX8405A,编码275 aa;组2,缺失87 bp(122-208),包括DNA-750和CX820,编码248 aa;组3,包括5RACE和DNA-8001,不发生组2的87 bp缺失,但因其序列较短,无法确认是否具备组1的6 bp缺失;组4,包括GynostemminI、III、IV、V以及EMUZW和RHXJB,既无87 bp缺失也不发生6 bp缺失,编码277 aa.其中GP609与其它葫芦科RIP的LY1/LY2区段的同源性,碱基水平为47%-61%,氨基酸水平为37%-49%.5RACE中包含了由23 aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC“,同时包含有5UTR序列,其中含有kozak序列“AAAAAA“.对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现,绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除,并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性,这种现象以前未见报道.分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点.5个含有3UTR的成员中,GynostemminI 比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element),其mRNA的稳定性可能因此受到影响.运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析.分别将GP609和RHXJB转入pGEX-2T融合表达载体,在大肠杆菌DH5α菌株中实现融合表达.将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达,表达产物对TMV的抑制效果很差,其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥.分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体,同时构建了含有RHXJB的pKYLX71∶35S2植物表达载体(ZW-pK).采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录.重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题.研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础,并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义.     

甘蔗花叶病的发生及甘蔗品种的抗性

在福建蔗区,甘蔗花叶病田间发病率因地区和品种而异。供试9个种及品种对甘蔗花叶病毒株系A的反应为:割手密野生种表现免疫;闽糖70/611和桂糖11表现抗病;福引79/9,F134和闽选703表现中抗;福引79/8表现感病,NCo310和Co740表现高度感病。本文还对田间花叶病的发生特点与品种抗性的关系及品种抗性鉴定的依据和标准等进行讨论。     

水稻条纹叶枯病的研究 Ⅳ.病叶细胞的病理变化

在水稻条纹叶枯病叶超薄切片的电镜检查中,可见一些叶肉细胞和维管束鞘细胞中叶绿体有不同程度的降解和淀粉粒累积,一些细胞不同程度坏死,叶肉细胞、维管束鞘细胞以及伴胞的细胞质或液泡中有一个或多个蛋白体存在,一些伴胞中有特异性的非外壳蛋白存在,一些细胞中有一些不定形的粒状内含体或砂状结构,而在病株的不同叶位,这种砂状结构数量不同,以+1叶所见最多.研究结果还佐证了前文有关叶绿体中淀粉粒的过量累积可能引起叶绿体的破坏及其后叶片褪绿病斑形成的假说,并推测这可能是同化产物的运输通道受到影响的结果.     

甘蔗花叶病毒的提纯及抗血清制备

以ＳｃＭＶ－Ａ为材料,采用ＰＥＧ沉淀结合差速离心技术,经１０－４０％蔗糖密度梯度离心后再经浓缩后即为提纯病毒制剂。该提纯病毒具有典型的核蛋白吸收曲线,最大紫外吸收值在２５７ｎｍ处,最小紫外吸收值为２４０ｎｍ,Ａ２６０／２８０＝１．６８,病毒产量可达１．２５－１．３７ｍｇ／ｋｇ。将提纯病毒免疫家兔制备抗血清,所制备的抗血清经Ａ蛋白酶联免疫吸附法测定,其效价为１／１０２４,且可用于检测甘蔗花叶病毒。     

应用A蛋白夹心酶联免疫吸附法鉴定黄瓜花叶病毒血清组

根据Ａ蛋白夹心酶联免疫吸附法（ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ）试验结果可以将我国分离的１６个黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）分离物及４个ＣＭＶ标准毒株（Ｆｎｙ、Ｌｎｙ、Ｍ、ＷＬ）区分为２个血清组．１４个分离物及标准毒株Ｆｎｙ、Ｍ属ＤＴＬ血清组，２个分离物及标准毒株Ｌｎｙ、ＷＬ属ＴｏＲＳ血清组     

棉花皱缩花叶病的初步研究

2007年湖北荆州地区一些棉田棉花叶片上发生一种新的棉花病害,暂定名为棉花皱缩花叶病。通过症状描述、电镜观察和生物学接种对其进行了初步分析。结果显示:该病害症状疑似病毒病,但与已经报道的棉花病毒病症状都不相同。电镜观察显示,病株叶片汁液中存在4种杆状病毒颗粒,大小分别约是18nm×300nm、18nm×500nm、18nm×800nm、18nm×1100nm。生物学接种结果表明,该病不能经种子、棉蚜、烟粉虱、汁液摩擦4种方式传播。     

我国水稻病毒病的回顾与前瞻

本文从我国所处的地理位置,结合国外主要水稻病毒病发生流行的动向,联系我国水稻病毒病的实际,历史地回顾并总结了水稻黑条矮缩病和暂黄病六十年代前中期及其以后几次大的流行的主要原因和经验教训;概要地综述了水稻病毒病的现状,介绍了我国发生的11种水稻病毒及类似病害的病原、分布、介体、传播和发生流行的一些关键因素,指出在全国稻区仍以暂黄病和矮缩病的发病面积最大,为害最重。病害在品种间的抗性有显著差异,只有适合流行的年份栽培大量感病品种,遇上大量带毒介体,流行才成为可能。展望未来的5年,     

南方菜豆花叶病毒(SBMV)两典型株系特异cDNA和RNA探针的制备及应用

南方菜豆花叶病毒（ＳＢＭＶ）主要有２株系：菜豆株系（ＳＢＭＶ－Ｂ）和豇豆株系（ＳＢＭＶ－Ｃ）,血清学方法不能予以区分。根据已报道的核酸序列设计了２对特异引物,进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆到载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中,序列测定予以证实后利用随机引物法合成放射性ｃＤＮＡ探针,再进行体外转译合成地高辛ＵＴＰ标记的ＲＮＡ探针。２种探针均可分别特异地检测Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ膜上的ＳＢＭＶ－Ｂ和ＳＢＭＶ－Ｃ。ＲＮＡ探针检测ＳＢＭＶ－Ｂ和ＳＢＭＶ－Ｃ灵敏度分别为：０．１μｇ和０．０１μｇ。     

植物病毒RNA间重组的研究现状

根据近几年来研究的最新资料，从植物病毒ＲＮＡ间的重组位点的特征以及重组体亲本链双方的来源的角度对植物病毒ＲＮＡ的重组类型作了介绍，并对其重组机制作了综述。