参与烟粉虱免疫反应的clip丝氨酸蛋白酶基因分析

为了解参与烟粉虱免疫反应的clip丝氨酸蛋白酶(clip-domain serine proteases in Bemisia tabaci,Bt CLIPs)基因,对已鉴定的8个Bt CLIPs基因编码的蛋白进行序列分析,与冈比亚按蚊、家蚕、黑腹果蝇、烟草天蛾4种模式昆虫的同源蛋白进行系统进化分析,并通过q RT-PCR检测球孢白僵菌侵染烟粉虱4龄若虫后Bt CLIPs的时间表达模式。结果显示,8个Bt CLIPs基因均为含有CLIPs结构域的丝氨酸蛋白酶基因;Bt CLIP19、Bt CLIP20和Bt CLIP21独自聚在进化树的一支上;其它Bt CLIPs均与4种模式昆虫中的1种或多种同源蛋白聚在一起;与对照相比,8个Bt CLIPs基因受球孢白僵菌侵染后在不同时间的相对表达量均上调,但诱导程度不同,48 h的相对表达量达最高,其中Bt CLIP19上调表达最明显,为对照组的71倍。研究表明,8个Bt CLIPs可能参与烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,并成为烟粉虱生物防治的新靶标。     

缢蛏丝氨酸蛋白酶基因的序列特征及其表达分析

含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶是一类新的丝氨酸蛋白酶家族,可能参与非特异性免疫防御功能。从缢蛏(Sinonovacula constricta)cDNA文库中筛选出一条丝氨酸蛋白酶同源EST序列,然后通过5’RACE扩增、测序,拼接得到全长为1 228 bp的cDNA序列,包括66 bp的5’非翻译区和160 bp的3’非翻译区,以及1 002 bp的开放阅读框。阅读框共编码333个氨基酸,含有17个氨基酸的信号肽序列,并含有发卡结构域(clip domain)和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域(Tryp_SPc domain)。在clip结构域中包含6个半胱氨酸残基形成的3个二硫键,在Tryp_SPc结构域中包含His-Asp-Ser催化三联体(HDS)。该缢蛏丝氨酸蛋白酶基因被命名为ScSP。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,ScSP在缢蛏的外套膜、水管、鳃、斧足、性腺、肝胰腺6个组织中均有表达,尤其在肝胰腺中表达显著高于其他组织,其次为性腺组织,而水管,外套膜和鳃中表达量最低。缢蛏经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)诱导感染后4 h和8 h,肝胰腺中的ScSP基因表达量显著上调。缢蛏丝氨酸蛋白酶的序列特征与表达分析揭示了ScSP是含有clip结构域的丝氨酸蛋白酶基因,参与了非特异性免疫防御,为进一步研究该基因的结构和功能奠定了基础。     

中华蜜蜂酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶相关基因 及其全长转录本发掘与分析

为深入开展中华蜜蜂相关研究提供参考信息和基础,利用已获得的纳米孔(Nanopore)测序数据对中华蜜蜂Apis cerana cerana的酚氧化酶(phenoloxidase, PO)和丝氨酸蛋白酶(serine protease, SP)相关基因和全长转录本进行发掘和分析。通过Blast工具将中华蜜蜂所有全长转录本比对KEGG和Nr数据库以筛选出PO和SP相关基因和全长转录本。采用gffcompare软件将PO和SP相关全长转录本与东方蜜蜂参考基因组(ACSNU-2. 0)已注释基因进行比较以优化结构。使用Astalavista软件鉴定PO和SP相关基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件,再利用IGV浏览器进行结构可视化。通过PCR验证AS事件的真实性。利用TAPIS pipeline预测和分析可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)位点,并通过TBtool软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因与146条转录本。优化了16个参考基因组已注释PO和SP相关基因的结构,其中5′端延长和3′端延长的基因均有7个,5′端和3′端同时延长的基因有2个。鉴定到PO和SP相关的10个基因的389次AS事件,其中最丰富的AS类型是5′端可变剪接。PCR结果证实了2次AS事件的真实性。共鉴定到34个PO和SP相关基因含有1个及以上的APA位点,其中含有3个APA位点的基因数量最多;在APA位点上游鉴定到多个motif,一致性序列为：GGHKSYWSHHTRATWTCNBHDMRRYWYRTNYTVACNGCKGCDCAYTGYR。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因和146条全长转录本,优化了东方蜜蜂参考基因组已注释的PO和SP相关基因结构,并发掘出PO和SP相关基因的389次AS事件和237个APA位点。     

微生物发酵法生产L-丝氨酸的研究

S112是经诱变获得的抗丝氨酸结构类似物和分解能力缺陷的突变株,丝氨酸产率是1.6 g/l.摇瓶试验初糖50 g/l,发酵37 h时补糖40 g/l,可有效提高产酸率50;左右.分批培养补氮试验表明补充氮源同时补糖与只补糖相比,产酸率差异不明显,说明丝氨酸产生菌产丝氨酸过程对氮源的需求不高.经发酵培养基氮源的筛选,认为10;鱼粉水解液是最优的.在7升发酵罐试验,没有补糖的情况下46 h开始产丝氨酸,46、54、58、62、66和72 h产酸率大致相同,为1.8 g/l.     

旋毛虫成虫丝氨酸蛋白酶对S774A.1巨噬细胞的毒性作用

为探究旋毛虫成虫排泄分泌抗原(ES)中丝氨酸蛋白酶对宿主免疫调节作用,用PCR扩增出旋毛虫成虫期特异性丝氨酸蛋白酶基因Zh68,克隆至表达载体pET28a,转化到大肠埃希菌BL21( DE3),经诱导表达后的重组蛋白免疫接种动物获取抗血清.将抗体封闭前后的ES分别作用于S774A.1巨噬细胞,CCK-8检测巨噬细胞的增...     

Effect of SerpinE2 on metabolism of extracellular matrix

Serpin peptidase inhibitor clade E member 2 (SerpinE2), a member of serine peptidase inhibitor super family, regulates multiple serine proteases. Extracellular matrix (ECM) plays an important role in stem cell differentiation, signal transduction, tumor metastasis, osteoarthritis physiological and pathological processes and so on. SerpinE2 regulates the protein of extracellular matrix by serine protease system and matrix metalloproteinase (MMP) system. In this paper, we elaborate the effect of SerpinE2 on metabolism of extracellular matrix, and it will provide new ideas to find new therapeutic targets.     

细胞信号肽酶复合体亚基1与牛病毒性腹泻病毒复制的相关性分析

旨在探明信号肽酶复合体亚基1(signal peptidase complex subunit 1,SPCS1)影响牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的作用。使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向SPCS1基因的sgRNA,克隆至慢病毒载体lentiCRISPR v2,连同包装质粒pSPAX2和pMD2.G转染至人胚肾细胞HEK-293T中,包装慢病毒并感染MDBK细胞,用嘌呤霉素筛选5代后获得敲低SPCS1蛋白后稳定表达的细胞,用Western blot检测SPCS1蛋白表达的情况;使用荧光定量PCR和免疫荧光分析检测BVDV感染SPCS1蛋白敲低细胞不同时间后5'非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA的水平和双链RNA(double-stranded,dsRNA)积累,利用倒置显微镜观察BVDV致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,根据Reed-Muench方法测定病毒滴度变化情况。结果：Western blot检测SPCS1蛋白表达量明显下降,成功构建SPCS1敲低(knockdown,KD)细胞;BVDV感染SPCS1 KD细胞后与对照Scramble相比,BVDV 5' UTR mRNA水平和dsRNA量均显著性降低(P < 0.01),CPE现象推迟并减弱,子代病毒滴度显著性下降(P < 0.01),最高降低95.8%。SPCS1敲低后显著性影响BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供理论依据。     

A recombinant 31.5 kDa keratinase and a crude exo-antigen from Microsporum canis fail to protect against a homologous experimental infection in guinea pigs

A Microsporum canis recombinant 31.5 kDa keratinase and a M. canis crude exo-antigen were tested as vaccines in an experimental infection model in guinea pigs. Animals were vaccinated subcutaneously three times at two-week intervals with either the keratinase, the exo-antigen or the adjuvant alone. Cutaneous challenge was performed blindly. Both humoral and cellular-specific immune responses to M. canis antigens were evaluated every 14 days, while a blind evaluation of clinical lesion development and fungal persistency in skin were monitored weekly. Vaccination induced very high and significant (P < 0.01) antibody responses towards both antigens. High cell-mediated immune responses to both immunogens were also induced by vaccination. After challenge, however, scores reflecting the severity of dermatophytic lesions did not differ significantly between vaccinated and control groups at any time after challenge. These results suggest that, in the guinea pig, the induction of specific immune responses against the M. canis-secreted antigens used in this study are not protective against challenge exposure.     

大豆胰蛋白酶抑制剂对鲢丝氨酸蛋白酶的作用

研究了大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)对鲢肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)引起的肌原纤维蛋白降解作用的影响。大豆胰蛋白酶抑制剂经高度纯化后加入肌原纤维中以判断它对MBSP的抑制效果。在不添加STI的情况下,55℃加热30min即可观察到肌球蛋白重链的分解,延长加热时间则可检测到肌动蛋白及原肌球蛋白的降解。相反,在终浓度为0.75μg·mL-1的STI存在下,包括肌球蛋白重链在内的肌原纤维蛋白降解均能得到有效抑制,表明STI是MBSP的特异性抑制剂。由于肌球蛋白重链及肌动蛋白的完整性是构成鱼糜制品凝胶强度的主要因素,因此,STI的添加有可能提高鲢鱼糜制品的凝胶强度。