大白菜 PHK4基因的功能初探

细胞分裂素参与植物生长和发育的许多生理过程。植物细胞分裂素受体属拟南芥细胞分裂素受体基因AHK4同源的细胞分裂于组氨酸蛋白激酶家族,是植物双组分信号系统的组分。克隆了大白菜的素受体基因PHK4（Pekinensis putative Histidine Kinase 4）,采用反向遗传学的方法对其功能进行分析,初步阐述了大白菜PHK4作为细胞分裂素受体起作用,对研究调控大白菜与细胞分裂素相关的生长发育过程奠定了理论基础。     

拟黑多刺蚁hsp90基因的RNA干扰及其对EcR和USP基因mRNA表达的影响

【目的】对拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)成虫热激蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)基因进行RNA干扰(RNAi),为分析hsp90基因的功能及将RNAi技术用于害虫防治提供参考。【方法】采用Trizol法提取拟黑多刺蚁总RNA,反转录合成cDNA第一链用于hsp90基因的克隆。利用T7RiboMAXTM Express RNAi System将hsp90合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),将其配制成120,60,30,15和7.5ng/μL的溶液饲喂拟黑多刺蚁雌蚁、雄蚁和工蚁成虫进行RNAi,共饲喂14d,记录成虫死亡率,确定dsRNA最适质量浓度,并以此剂量对各品级成虫进行干扰,通过荧光实时定量PCR,检测干扰效果及干扰hsp90基因对EcR、USP mRNA表达的影响。【结果】成功获得拟黑多刺蚁hsp90基因片段,其长度523bp,并合成了dsRNA。饲喂dsRNA后发现,dsRNA质量浓度越大,拟黑多刺蚁死亡率越高,在dsRNA质量浓度为120ng/μL时,饲喂5d后成虫全部死亡;30ng/μL是dsRNA干扰的最适质量浓度。以30ng/μL dsRNA干扰后,荧光实时定量PCR结果表明,拟黑多刺蚁每个品级成虫hsp90基因mRNA均被沉默。hsp90基因被干扰后,EcR的表达没有显著变化,USP的表达显著降低。【结论】采用饲喂法成功干扰了拟黑多刺蚁hsp90基因mRNA的表达;hsp90基因与USP基因表达有一定的相关性。     

拟南芥Mg2+转运蛋白AtMGT10的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】在大肠杆菌系统中原核表达拟南芥叶绿体Mg~(2+)转运蛋白AtMGT10,通过免疫健康成年家兔,获得针对AtMGT10蛋白的多克隆抗体,为研究AtMGT10蛋白在植物生长发育中的功能奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆AtMGT10基因编码区187~786bp的cDNA片段,连接到pET-28a中构建原核表达载体pET-28aAtMGT10~(63-262),转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达带有His标签的His-AtMGT10~(63-262)截短重组蛋白。用镍柱亲和纯化后的重组蛋白作为抗原皮下注射免疫家兔,制备针对AtMGT10蛋白的多抗血清。提取拟南芥野生型叶片总蛋白,用AtMGT10多抗血清进行蛋白免疫印迹检测。【结果】经PCR扩增获得了600bp的AtMGT10基因cDNA片段,成功构建原核表达载体pET-28a-AtMGT10~(63-262),在大肠杆菌系统中表达出His-AtMGT10~(63-262)蛋白,经亲和纯化后免疫家兔获得了Anti-AtMGT10多抗血清。在拟南芥野生型总蛋白中用Anti-AtMGT10经免疫印迹检测到大约50ku的蛋白条带,利用抗原竞争试验进一步证明检测到的信号就是拟南芥内源AtMGT10蛋白。【结论】原核表达了His-AtMGT1063-262蛋白,成功制备了特异性较强的AtMGT10蛋白多克隆抗体。     

赤拟谷盗章鱼胺受体3(TcOctβR3)cDNA克隆、表达及功能

【目的】章鱼胺信号系统在调节昆虫行为和生理过程中具有至关重要的作用。赤拟谷盗(Tribolium castaneum)作为一种模式昆虫,被广泛用于解析昆虫生长发育及生理等调控机制的研究工作。本研究以赤拟谷盗为对象,旨在明确章鱼胺受体在调节赤拟谷盗行为和生理方面的功能。【方法】根据Gen Bank登录的相关序列信息(XP_008198078),利用RT-PCR技术克隆赤拟谷盗章鱼胺受体基因Tc OctβR3的c DNA序列。利用在线生物信息学分析软件预测该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列以及跨膜结构域等信息,基于邻接法构建该基因与其他昆虫相关序列的系统发育树,明确系统进化关系。分别提取赤拟谷盗各发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)、不同组织(中枢神经系统、脂肪体、中肠、后肠、马氏管、精巢和卵巢)以及饥饿胁迫后的RNA,以赤拟谷盗核糖体蛋白S3(Tc RPS3)为内参基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在赤拟谷盗不同发育阶段、不同组织以及在饥饿胁迫下的表达模式。运用哺乳动物异源表达系统在人胚胎肾细胞HEK293中瞬时表达Tc OctβR3,进而利用第二信使c AMP含量测定技术分析Tc OctβR3与配体的结合能力。最后,通过体外合成赤拟谷盗Tc OctβR3的双链RNA,利用RNA干扰以及轨迹球行为分析等技术探究该基因的生理功能。【结果】序列分析结果表明,赤拟谷盗Tc OctβR3开放阅读框全长1 305 bp,编码434个氨基酸,序列中含有G蛋白偶联受体典型的7个跨膜结构域。基于邻接法构建的系统发育树表明,该基因编码的蛋白质与小蜂甲(Aethina tumida)的OctβR3亲缘关系最近。实时定量PCR分析结果表明,Tc OctβR3在赤拟谷盗各发育阶段均有表达,尤其在低龄幼虫期转录水平最高,而在其他发育阶段表达量无显著差异;在赤拟谷盗不同组织中,Tc OctβR3在中枢神经系统的表达量显著高于其他组织;赤拟谷盗幼虫在经饥饿处理24 h的过程中,Tc OctβR3的表达量呈先下降后上升的趋势,且在处理6 h的表达量最低,为对照的0.47倍,在16 h表达量最高,为对照的1.80倍,最后恢复到正常水平。通过HEK293细胞异源表达Tc OctβR3后,c AMP测定结果表明章鱼胺(OA)呈浓度依赖性地激活Tc OctβR3,其EC50为8.68×10-7 mol·L-1,萘甲唑啉(NA)的激动活性最高,其有效中浓度EC50为8.56×10-8 mol·L-1。4种供试生物胺激动剂活性强弱为:萘甲唑啉酪胺(TA)章鱼胺多巴胺(DA)。进一步采用RNA干扰技术的分析结果表明,注射ds RNA能有效抑制Tc OctβR3的表达,沉默效率高达61.5%,但干扰该基因表达后不会影响赤拟谷盗成虫的爬行速度和产卵量。【结论】Tc OctβR3在赤拟谷盗中枢神经系统可能发挥重要作用,能调节幼虫对饥饿胁迫的响应。明确了Tc OctβR3的分子生物学特性,可为将来以其为靶标筛选高效激动剂和抑制剂提供理论依据。     

甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列,分析Sc-ERS基因启动子序列的作用元件。【方法】采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术,从甘蔗ROC22基因组DNA中克隆Sc-ERS基因启动子序列,利用启动子预测软件PlantCARE和PLACE在线工具对Se-ERS启动子序列的作用元件进行预测。【结果】克隆获得sc．ERS启动子序列1410bp,该序列与玉米ERS25、ERS14核苷酸同源性分别为82％和80％。PlantCARE在线分析结果表明,该序列具有启动子基本作用元件TATA．BOX和CAAT—BOX,还含有参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、茉莉酸甲酯响应元件、水杨酸响应元件、胚乳表达顺式调控元件、热胁迫响应元件等。【结论】从甘蔗基因组DNA中克隆获得乙烯受体Sc-ERS基因上游1410bp的启动子序列,该序列含有多个特异性调控元件,推测sc．ERS;~因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。     

牛分支杆菌CFP-10的原核表达及其在牛结核病诊断中的应用

低分子质量的蛋白抗原CFP-10是一种重要的牛分支杆菌早期分泌蛋白.为了检测该蛋白和其他几种抗原在牛结核病诊断中的临床应用,对CFP-10的基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达.PCR法扩增cfp-10基因片段,连接到pET-22b( )原核表达载体中,再转入表达宿主E.coli BL21(DE3)PlysS菌株内,用IPTG诱导,进行蛋白表达、纯化.分别以CFP-10、ESAT-6、MPT83、MPT70、牛PPD、CFP-10与ESAT-6混合蛋白,MPT83与MPT70混合蛋白为抗原,用间接ELISA法诊断牛结核病.结果表明,以CFP-10与ESAT-6混合蛋白作为抗原检测牛结核病的特异性和敏感性分别达到了100%和63.6%,均超过了其他单抗原或抗原组合,为以筛选合适抗原为基础的血清学诊断技术提供了有力的支持并创造了良好的应用前景.     

乙烯受体ETR1基因同源性分析及乙烯敏感性与植物采后寿命的关系

将37种不同科属植物及5个不同月季品种的ETR1核苷酸、氨基酸序列进行同源性分析并构建了分子系统发生树,并对植物的呼吸跃变类型、乙烯敏感性及采后寿命的关系进行了归纳和分析.结果表明,在核苷酸水平上,分子性状的同源性与形态性状同源性具有一致性,但月季不同品种种间差异大于异源植物的属间差异.氨基酸序列的同源性分析结果与核苷酸相似,但仍存在差异,可能由于氨基酸密码子简并性、翻译起始位置的不同、ETR1片段大小的差异所造成.在蛋白质水平上,所分析的ETR1片段均具有高度保守结构域.植物的呼吸跃变类型虽与内源乙烯的生成有密切的关系,但与外源乙烯的敏感性无直接关系;植物对外源乙烯的敏感性与植物采后寿命的关系更为密切.     

A role for Toll-like receptor 4 in the host response to the lung infection of Yersinia pseudotuberculosis in mice

Although a Yersinia pseudotuberculosis (Yptb) lung infection model has been developed to study Y. pestis pathogenesis, it is still necessary to establish a new animal model to mimic the pathophysiological features induced by Y. pestis infection. Here, we provide a new lung infection model using the Yptb strain, IP2777, which displayed rapid spread of bacteria to the liver, spleen, and blood. In addition, we examined whether TLR4 is involved in Yptb-induced pathogenesis in the lung infection model of mice we generated. Following lung infection of WT and TLR4-deficient mice with the Yptb strain IP2777, the survival rate, bacterial colonization, histopathology, and level of cytokines and chemokines in the lung, spleen, liver, and blood were analyzed. TLR4-deficient mice had a lower survival rate than WT mice in response to Yptb lung infection. Although the bacterial colonization and pathology of the lung were comparable between WT and TLR4-deficient mice, those of the spleen and liver were more severe in TLR4-deficient mice. In addition, the levels of TNF-α and CXCL2 in the liver and IL-6 and CXCL2 in the blood were higher in TLR4-deficient mice than in WT mice. Our results demonstrate that TLR4 is necessary for optimal host protection against Yptb lung infection and TLR4-deficient mice may serve as a better genetic model of Yptb infection for mimicking Y. pestis infection.     

ER-α36 and miR-143 involved in invasion of gastric cancer cells

AIM: To investigate the relationship between the expression of estrogen receptor α36 (ER-α36) and the invasion of gastric cancer cells. METHODS: SGC7901 cells were treated with 17β-estradiol at high or low concentration. The invasion of gastric cancer cells and the expression of ER-α36 were detected. The SGC7901 cells with the characteristics of stable low expression and high expression of ER-α36 were constructed. The invasion ability and microRNA sequences were determined in above-mentioned recombinant cells. RESULTS: The decreased invasion ability and ER-α36 expression were detected in SGC7901 cells treated with low concentration of 17β-estradiol. The situation was the opposite in the cells treated with high concentration of 17β-estradiol. The expression of miR-143 was significantly decreased in the SGC7901 cells with stable high expression of ER-α36 and was increased in the SGC7901 cells with stable low expression of ER-α36. CONCLUSION: The expression of ER-α36 is positively related to the invasion of gastric cancer cells. It is possible that miR-143 plays an important role in the regulation of gastric cancer invasion.     

Hmgn3和Hoxa10对小鼠子宫基质细胞蜕膜化过程中Foxo1表达的调控

利用小鼠子宫基质细胞体外诱导蜕膜化模型转染Hmgn3或Hoxa10过表达载体及siRNA片段,通过荧光定量PCR方法检测Hmgn3和Hoxa10对Foxo1表达的调控。结果显示:转染Hmgn3或Hoxa10过表达载体可促进Foxo1在子宫基质细胞蜕膜化过程中的表达,而转染Hmgn3或Hoxa10siRNA则可抑制Foxo1的表达。在小鼠子宫基质细胞中转染Hmgn3或Hoxa10siRNA后再添加孕酮,Foxo1的表达显著下降。同样,干扰Hmgn3或Hoxa10也可减低cAMP对Foxo1表达的调控。结果表明:Hmgn3和Hoxa10可通过Foxo1来影响小鼠子宫基质细胞的蜕膜化,孕酮和cAMP可通过Hmgn3和Hoxa10来调控Foxo1在子宫基质细胞中的表达。