番茄成熟突变体(rin,nor,alc)及其F_1的贮藏生理特性研究

本研究对番茄成熟突变体rin、nor、alc材料与正常成熟番茄品种及其杂种一代果实,在绿熟期采收后果实的呼吸强度、乙烯释放量及多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性进行了测定和分析。结果表明:具rin、nor、alc基因的番茄果实无呼吸和乙烯跃变期,其硬度降低慢,果实中PG活性较低,它们的贮藏指数是正常成熟番茄的3倍,一般可贮藏2～3个月,其与正常番茄亲本品种交配的F_1杂种果实(rin/+,nor/+,alc/+)均有一小的呼吸、乙烯高峰出现,但跃变期比正常番茄推迟5～7天,达跃变期时,果实释放的CO_2和乙烯量是正常番茄的40％～6％,PG活性和硬度变化介于双亲之间,果色与正常成熟番茄相近,果实的耐贮藏性较正常番茄有所提高。     

玉米暗形态建成突变体的筛选

双子叶植物的下胚轴和单子叶植物的中胚轴的生长模式是暗形态建成和光形态建成的重要标志性发育事件,黑暗促进其延伸,而光照则抑制其生长。拟南芥下胚轴的形态建成受光信号通路与植物激素途径中许多重要基因的调控,这些基因在农作物中的同源基因,往往也与许多重要的农艺性状有关。基于此,以玉米的中胚轴在暗形态建成中的长度作为表型标记,从EMS突变体库中(包含6 150份郑58背景株系和2 340份B73背景株系)筛选获得96株中胚轴长度异常的突变体。进一步对其中两个突变体进行了初步分析,发现这两个突变体在BR信号途径发生缺陷。玉米暗形态建成突变体的获得将不仅有助于解析玉米对光信号的应答,而且有助于揭示光信号通路与其他信号途径的互作。     

利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

目的 将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。方法 分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1 μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3 μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。结果 建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLV-sgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。结论 利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。     

基于PCR的两步法丝状真菌基因敲除方法

基因敲除是研究真菌基因功能的重要方法之一,目前,丝状真菌敲除多采用基因两侧的同源臂对基因组的靶标进行同源替换,然后采用抗生素对转化子进行筛选,但这存在着筛选效率低、假阳性率高、操作复杂等问题。本研究以稻瘟菌为研究对象,采取以下步骤对此进行优化:1)构建HPH-GFP(潮霉素-绿色荧光蛋白)融合表达载体; 2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因上、下游片段; 3)克隆上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段; 4)嵌合体片段转化真菌原生质体; 5)对敲除突变体进行筛选。结果表明,该法操作简便、高效,除了用潮霉素HPH作为筛选标记外,还可用GFP作为荧光筛选标记,极大提高了筛选效率,可用作丝状真菌基因功能研究。     

小麦赤霉菌FGSG＿05656基因敲除及功能分析

小麦赤霉菌FGSG05656基因在MGV1敲除突变体中显著下调,为了进一步研究其生物学功能,本研究采用Split-Marker基因敲除技术,构建了含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒。通过聚乙二醇(PEG)法转化野生型原生质体。潮霉素(Hygromycin)选择培养基筛选转化子后,PCR正负筛选鉴定敲除突变体。基于缺失突变体的表型和感染能力的变化来分析FGSG05656基因的生物学功能。与野生型PH-1相比,敲除突变体的生长速率和分生孢子数显著减少,表明FGSG05656基因可能参与菌丝体的生长和分生孢子的发生。植物感染试验显示缺失突变体与野生型之间没有显著差异。分生孢子是病原菌感染寄主的主要器官,它的减少可以显著减弱病原菌的扩散,FGSG05656基因敲除突变体分生孢子显著减少,这一结果对于进一步研究分生孢子发生的分子机理具有重要意义,同时为小麦抗病分子育种提供依据。     

花生EMS诱变体系的探索及突变体鉴定

突变体创制对花生遗传改良和功能基因组学研究具有重要意义。为获得最佳诱变效果,本研究对不同基因型花生品种的EMS诱变条件进行摸索,发现花育22号、花育71、花育9301、狮头企和伏花生的最适诱变浓度分别为0.4%、0.5%、0.3%、0.5%和0.3%。通过对最适EMS浓度诱变处理下苗期芽长、株高、根长及根数目分析,发现5个品种虽然都能正常成苗,但均受到较严重的损伤。在预实验基础上,用浓度为0.4%的EMS溶液处理了大约5000粒花育22号种子,M1及M2世代性状调查显示突变群体表型丰富,出现株高、株型、荚果、籽仁、分枝数、叶形等表型变异株系,表型变异率为12.9%。本研究为花生遗传改良和功能基因组学研究提供了丰富的种质材料。     

PK-15细胞的ISG15基因敲除促进PRV的复制

本试验旨在研究干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15,ISG15）敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG15基因敲除猪肾上皮（PK-15）细胞系,利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG15基因对细胞活力的影响,采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15^-/-细胞感染PRV的增殖差异,通过RT-qPCR检测PRV-EP0、PRV-gE、PRV-VP16和IFN-β的转录水平,Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平,以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG15基因;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,敲除ISG15基因对PK-15细胞活力无影响;间接免疫荧光检测结果表明,PRV感染后,PK15-ISG15^-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞;RT-qPCR和Western blot结果表明,敲除ISG15可以促进PRV的转录和蛋白表达;病毒噬斑试验进一步显示,敲除ISG15可以促进PRV的复制。另外,RT-qPCR结果显示,敲除ISG15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15^-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实ISG15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖,并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。     

C57小鼠和C57BL/6 FMR1 KO小鼠剖宫产手术及其仔鼠生长情况的比较研究

目的 C57BL/6小鼠和C57BL/6 FMR1 KO小鼠剖宫产手术及其仔鼠生产情况的比较。方法将C57和FMR1两种小鼠分成两组,每组雌雄按1:1配对,通过剖宫产手术取得仔鼠,C57母鼠作为代乳母鼠,分别比较两种小鼠的妊娠时间、成功受孕时间、7 d成活率、产仔数、离乳率。结果 FMR1小鼠在成功受孕时间、7 d成活率、离乳率上与C57小鼠存在显著差异。结论通过剖宫产净化手术获得FMR1小鼠,为后续开展保种和育种工作提供重要保障。     

三叶青突变体的理化成分评价与分子鉴定

为探究三叶青品种泽青1号是否产生药理成分突变,对26份三叶青样本的可溶性多糖、总酮、总皂苷、总酚、蛋白质、矿物质及游离氨基酸进行了理化评价与相关性分析,并检测了其ITS序列的位点突变情况。结果筛选出103、107、109、112、113、125、126、127、130、131、132等优异突变体。泽青1号突变体类群与其23个近缘崖爬藤属种间同源性为49%、平均遗传距离为0.54、组间距离为0.993;泽青1号突变体间同源性为93%~99%、配对距离为0.006 40~0.116 96、组内距离为0.060 70,成功构建了基于ITS种属鉴定的突变体DNA条形码。本研究初步筛选出11个具有多元化定向育种应用价值的突变体,为解决三叶青种质资源稀缺、退化的问题提供了材料基础;同时基于ITS分子标记成功鉴定并区分泽青1号突变体类群与其他近缘崖爬藤属物种,筛选出突变类群的突变位点,为三叶青突变体种质资源评价提供了技术支撑。