气肿疽梭菌CctA基因的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

研究旨在原核表达气肿疽梭菌细胞毒素A （CctA）基因,用纯化的重组蛋白建立其间接ELISA检测方法,a。利用大肠杆菌密码子的偏爱性优化CctA基因序列,克隆至原核表达载体pET-28a （+）,双酶切鉴定原核表达质粒pET28a-CctA并测序。将重组质粒转入大肠杆菌,经IPTG诱导得到高表达的重组CctA包涵体蛋白。包涵体蛋白变性后经镍（Ni）柱纯化,SDS-PAGE检测其纯化效果。以豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清为一抗,用Western blotting方法检测重组CctA蛋白的反应原性。用棋盘滴定法建立间接ELISA检测方法,以复性后的重组CctA蛋白作为检测抗原,摸索抗原包被浓度、封闭液的种类及浓度、抗体的最适稀释度和反应条件等。选用3批气肿疽灭活疫苗免疫豚鼠后采集血清,同时用攻毒和间接ELISA两种方法验证疫苗的免疫效力。质粒双酶切结果显示,得到大小约853 bp的条带,与预期相符,且测序结果正确。SDS-PAGE结果表明,成功表达并纯化大小为35 ku的重组CctA蛋白。Western blotting结果显示,豚鼠抗气肿疽梭菌抗血清与重组CctA蛋白具有良好的反应原性。建立的间接ELISA法的最适条件为：抗原的包被浓度为0.5 μg/mL,于4 ℃包被过夜;封闭液选择10%胎牛血清,37 ℃孵育2 h;二抗的稀释度为1：8 000;室温避光显色10 min后终止反应,测定D_{450 nm}值。当P/N>4.6时,间接ELISA法检测结果与豚鼠攻毒试验结果拟合度较好。本研究成功表达CctA基因并纯化了重组CctA蛋白,建立的以重组CctA蛋白为检测抗原的间接ELISA检测方法,有望成为气肿疽灭活疫苗免疫效果验证的替代方法。     

miR-18a-5p在鸡不同生长时期的表达及其生物信息学分析与靶基因预测

为探究miR-18a-5p在鸡不同生长时期组织表达变化规律及其生物信息学特点,本研究以苏禽3号鸡为试验动物,利用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期鸡miR-18a-5p的组织表达变化。通过文献和miRBase检索脊椎动物的miR-18a-5p序列,利用Ensembl数据库确定miR-18a-5p在基因组中的位置,根据成熟序列构建系统进化树;使用miRmap、microT、miRanda和TargetScan网站预测miR-18a-5p靶基因,并进行GO和KEGG分析。组织表达分析结果显示,miR-18a-5p序列在鸡心脏、脾脏、肾脏和下丘脑中的表达量显著高于除大脑以外的其他组织(P<0.05)。与3日龄雏鸡相比,90日龄鸡心脏、脾脏、肾脏、腿肌和下丘脑中miR-18a-5p的表达量均显著上升(P<0.05)。在50种脊椎动物中共发现52条miR-18a-5p序列,几乎所有物种都只有1条成熟序列;基因定位分析发现,鸡miR-18a-5p位于1号染色体上的基因间隔区。多序列比对分析表明,不同物种miR-18a-5p的成熟序列同源性较高,物种间较为保守。系统进化树分析发现,鸡miR-18a-5p与原鸽、斑胸草雀等其他鸟类聚为一类,这表明miR-18a-5p进化过程中是保守的。靶基因预测和功能分析发现,miR-18a-5p共有121个靶基因。GO分析结果显示,靶基因主要富集到蛋白质泛素化、细胞周期阻滞、白细胞介素-6产生的负调控等功能。KEGG 通路分析表明,靶基因主要富集到细胞周期及Wnt和FoxO信号通路等。多个与肌肉生长及细胞增殖等相关的基因富集到相关通路之上。综上,鸡miR-18a-5p是组织广泛表达的miRNA,其可能通过Wnt及FoxO信号通路调控肌肉生长及细胞增殖分化。本研究为miR-18a-5p功能及调控机制的深入研究提供参考依据。     

Seroprevalence,associated risk factors analysis and first molecular characterization of chlamydia abortus among Egyptian sheep

Chlamydia abortus is one of the most common abortive agents worldwide in sheep. Few studies have been reported C. abortus infection among sheep in Egypt but the available data is scarce. The objective of the present study was to determine the seroprevalence of C. abortus among sheep, the associated risk factors and its molecular characterization. The present study was conducted on 675 sheep in six Governorates at Northern Egypt. Data analysis confirmed the presence of antibodies against C. abortus in 93 out of 675 sheep. The logistic regression model was fitted to identify the associated risk factors with C. abortus infection. The results revealed that C. abortus increased significantly in ewes (OR = 4.04, 95 %CI: 1.44−11.28) during autumn season (OR = 3.6, 95 %CI: 1.64–8.28), in ewes with a history of abortion (OR = 1.4, 95 %CI: 0.87–2.50) and in farm where no lambing pen (OR = 2.2, 95 %CI: 1.30–3.94) or abscence of post abortion measures (OR = 1.96, 95%CI: 1.23-3.12). In addition, age, flock size and exchange of breeding ram had no significant effect on prevalence of chlamydiosis. Also, PCR assay was confirmed presence of C. abortus as accusative pathogen in aborted ewe and the genetic characterization of Egyptian C. abortus strain revealed 100 % identity with another strain from Iraq. A control program should be applied to reduce economic losses and risk of human infection.     

Carrier rate of the c.235G>C mutation in the bovine isoleucyl-tRNA synthetase (IARS) gene of Japanese Black cows at Kagoshima prefecture, Japan,and analysis of the metabolic profiling and reproductive performance of heterozygous cows

Bovine isoleucyl-tRNA synthetase (IARS) disorder, a major cause of weak calf syndrome, is caused by a homozygous missense (c.235G>C) mutation in the bovine IARS gene of Japanese Black (JB) cattle, which was identified in 2013. However, the extent to which the carrier rate has changed at Kagoshima prefecture, Japan, and whether the carrier status is associated with any clinical or reproductive problems, have yet to be ascertained. In this study, using a real-time polymerase chain reaction-based genotyping assay, we determined the carrier rate in a regional JB cow population at Kagoshima prefecture. Comparative analyses were performed on the metabolic profile test (MPT) results and reproductive performance data obtained for heterozygous carrier and homozygous wild-type cows. In 2009 and 2018, DNA samples were collected from 130 and 462 clinically healthy JB cows, respectively, in Kagoshima prefecture. MPT results and reproductive performance data were evaluated for 62 cows, comprising four heterozygous carriers and 58 wild-type cows. Genotyping revealed that the carrier rate was 6.9% in 2009 and 1.5% in 2018, the difference of which was statistically significant (P<0.005). There were no statistically significant differences between the carrier and wild-type cows with respect to either MPT results or reproductive performance, indicating that the carrier cows have necessary IARS activity to maintain minimal health and reproductive potential.     

绵羊Musclin基因真核表达载体的构建及其对肌细胞糖代谢和胰岛素作用的影响

为了研究绵羊Musclin对糖代谢和胰岛素作用的影响,本试验运用生物信息学软件对其结构特征进行预测,并构建绵羊Musclin基因真核表达载体.分4组对绵羊胎儿成肌细胞进行处理:空载体组(pcDNA3.1)、Musc-lin 过表达组(pcDNA3.1-Musclin)、空载体+胰岛素组(pcDNA3.1+Insulin...     

SPF大白猪和长白猪CIITA基因剪接突变体的鉴定分析及在不同组织中的表达模式

为了鉴定分析SPF大白猪和长白猪CIITA剪接突变体,研究其在猪不同组织中的表达模式.本研究以5周龄的8头SPF大白猪和7头SPF长白猪为研究对象,设计特异性引物对CIITA基因进行扩增、克隆和测序,对获得的序列分析其剪接突变体特征,利用在线软件对不同剪接突变体进行生物信息学分析,同时利用荧光定量PCR方法检测CIIT...     

东亚和南亚固有绵羊群体X-蛋白等位基因特有频率分布的研究

本研究利用单向水平板淀粉凝胶电泳以我国5个固有地方绵羊品种包括湖羊（Hu）、同羊（Tong）、滩羊（Tan）、小尾寒羊（Han）、洼地羊（WD）为研究对象对X-蛋白遗传多样性进行了检测,并引用我国周边国家、地区绵羊品种为分析背景。结果表明以喜马拉雅山脉为界的亚洲东部和南部的北部群体和南部群体在编码的X（＋）型的显性等位基因X频率上存在极显著差异（P〈0．01）。北部检测的群体中X等位基因频率范围为0～0．18,平均值为0．0878,包括属于藏羊和蒙古羊系统的小尾寒羊（Han）、不丹羊（Bhutan）、同羊（Tong）、湖羊（Hu）、滩羊（Tan）、洼地绵羊（WD）、Bhyanglung绵羊（Bhy）、Baruwal绵羊（Bar）、云南绵羊（Yunnan）、哈拉和林绵羊（Kh）和乌兰巴托绵羊（Ub）。南部检测的群体中X等位基因频率范围为0．2037～0．4655,平均值为0．3082,包括属于印度绵羊系统的孟加拉国绵羊（Ban）、Kagi绵羊（Kagi）、Lampuchhre绵羊（Lamp）、越南占部落绵羊（Cham）和缅甸绵羊（Mya）。本研究揭示X等位基因可作印度绵羊的标记,在绵羊群体尤其是亚洲东部和南部绵羊系统形成的研究中具有潜在的重要作用。     

IBV AH1-99分离株N基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术成功扩增出IBV AH1-99分离株的N基因全长cNDA,将其克隆到pMD18-T载体上。经酶切分析、PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得该分离株N基因的重组质粒。序列分析结果表明,分离株N基因全长1 230个核苷酸,编码409个氨基酸。同部分IBV参考毒株相比,核苷酸同源性为85.8%~89.9%,氨基酸同源性为86.6%~91.0%,在进化关系树中,AH1-99与国内分离株X、LX4亲缘关系较近。     

抑制性消减杂交技术在对虾基因克隆中的应用

抑制性消减杂交技术是一项筛选、分离未知差异表达基因的试验方法,该技术具有快速、简便、灵敏、特异、高效,所需起始样本量较少等优点。利用该技术构建对虾组织消减cDNA文库,鉴定差异表达相关基因及其表达特性。通过对对虾差异性表达的免疫相关基因、抗病基因及其他性状基因的了解,旨在为进一步研究对虾抗病机理奠定基础,为利用抗病基因进行抗病育种提供一个有效途径,为提高对虾的经济效益提供前景。     

O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。