猪支原体肺炎LAMP-LFD快速检测方法的建立及初步应用

旨在采用环介导等温扩增（LAMP）和横向流动试纸条（LFD）相结合的方法，建立一种快速、特异，过程可视化的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）检测方法。针对猪肺炎支原体（Mhp）P36基因设计5套特异性引物和1条异硫氰酸荧光素（FITC）标记的探针，进行LAMP扩增反应。将生物素标记的LAMP产物与FITC标记的探针进行特异性杂交，并使用横向流动试纸条完成扩增产物的检测。经优化，LAMP最佳反应条件为65℃，反应15 min，从基因组DNA提取到LFD结果判断只需40 min左右，比常规PCR技术缩短近2 h。LAMP-LFD可特异性地检出猪肺炎支原体（Mhp），对猪鼻支原体（Mhr）及猪圆环病毒（PCV）等常见猪病病原的检测结果为阴性。灵敏性试验表明，LAMP-LFD对Mhp的检测灵敏度为1×10⁰个拷贝DNA，是普通PCR的1 000倍。利用本方法可从采集的88份临床疑似病料样品中检测到64份阳性，国标PCR方法可检测到56份阳性，符合率可达90.9%。综上，本研究建立的LAMP-LFD方法可特异、准确地应用于Mhp的检测，而且灵敏度高、操作简单、仪器设备依赖性低、检测成本低、耗时短，适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用，具有较高的推广价值，有望发展成为Mhp快速检测的有效手段。     

南芥菜花叶病毒RT-PCR扩增产物胶体金层析和酶联检测方法的建立

南芥菜花叶病毒是我国进境植物检疫性有害生物,为建立快速灵敏的检疫检测方法,本研究用生物素标记一条引物,用荧光素(或地高辛)标记另一条引物,经RT-PCR扩增产生双标记的扩增产物,建立了PCR扩增产物的胶体金层析检测和ELISA检测方法。胶体金层析检测方法在15min即可获得检测结果,ELISA方法需20h,后者检测的灵敏度可比前者分别提高100倍和5000倍。所建立的2种方法都免去了普通PCR检测的溴化乙锭染色和电泳的过程。     

Screening for proteinuria in cats using a conventional dipstick test after removal of cauxin from urine with a Lens culinaris agglutinin lectin tip

Proteinuria is an important indicator of urinary tract disease and urine dipsticks are simple and sensitive tools to screen for this marker. However, the use of dipsticks to screen for proteinuria may not be appropriate in cats, since cauxin, a 70 kDa glycoprotein, is secreted by the kidneys in clinically normal animals of this species. To circumvent this problem, a Lens culinaris agglutinin (LCA) lectin tip was developed to remove cauxin from feline urine, followed by conventional urine dipstick testing for proteinuria. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) with Coomassie brilliant blue R-250 staining indicated that >90% cauxin in the urine of 13 clinically normal cats was trapped by the LCA lectin tip, so that the dipstick protein ‘score’ changed from ‘positive’ (?30 mg/dL) for untreated urine to ‘negative’ (?10 mg/dL) for lectin tip-treated urine. In contrast, SDS–PAGE indicated that lectin tip-treated samples from 20 animals with renal disease contained high concentrations of albumin and low-molecular weight proteins; dipstick testing of lectin tip-treated urine resulted in a consistently positive protein score. The accuracy of the dipstick method for detecting cats with abnormal proteinuria is enhanced if dipsticks are used with urine samples that have first been passed through the LCA lectin tip.     

重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒

[目的]为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus,SGIV）的方法。[方法]本研究针对SGIV特异基因ORF014序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）技术及结合侧流层析试纸条（lateral flow dipstick, LFD）（RPA-LFD）的SGIV检测技术。[结果]RPA反应使用10 μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为100个／μl。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为10个／μl,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。[结论]RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。[意义]RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。     

联合环介导等温扩增和横向流动试纸条可视化检测副猪嗜血杆菌

为快速鉴定临床上的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)感染,本研究采用环介导等温扩增(LAMP)技术结合横向流动试纸条(LFD)测定法进行核酸扩增和结果的可视化判定。选择副猪嗜血杆菌inf B基因中保守序列设计5组环介导等温扩增引物,筛选最适引物组;用生物素和6-FAM标记内引物用于LAMP扩增反应,结合LFD建立了副猪嗜血杆菌LAMP-LFD快速检测方法,并测试该方法的特异性、灵敏度、重复性和临床应用效果。结果表明：1)优化后的LAMP在66℃下运行30 min, LFD可以在5 min内特异性、直观地检测到副猪嗜血杆菌;2)特异性强,与其他5种细菌无交叉反应;3)敏感度高,其最低检测浓度为1.285×10^-12 ng/μL,较普通PCR方法灵敏度显著提高;4)采用该方法对52份临床样品进行检测,副猪嗜血杆菌阳性率为19.2%(10/52),与LAMP检测结果的符合率为100%。综上,本研究建立的LAMP-LFD方法可特异、灵敏、准确地应用于副猪嗜血杆菌的可视化检测,而且操作简单、仪器设备要求及检测成本低、耗时短,适用于基层养殖场副猪...