TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用

根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒Ⅳ基因序列,设计了一对特异性引物和探针,扩增长度为186bp的片段。以克隆Ⅳ基因的质粒作为阳性标准品,建立了一种快速检测猪流行腹泻病毒含量的TaqMan荧光定量PCR方法。该方法在10^9-10^1copies／μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10copies／μL的质粒DNA,以猪圆环病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒为模板时,均检测不到荧光信号,而重复性实验中其变异系数均小于2％,表明此方法具有很好的特异性和重复性。应用此方法对采集的60份,陆床样品进行检测,其阳性检出率为92％,而用常规RT-PCR方法进行检测,阳性检出率仅为80％。表明荧光定量RT-PCR方法的敏感性明显高于常规PcR检测方法。     

快速检测A型流感病毒的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法的建立

根据A型流感病毒基质蛋白（matrix protein,M）基因保守序列设计并合成特异性引物和TaqMan BHQ探针,建立快速检测A型流感病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆A型流感病毒M基因靶序列并将其连入pMD-18T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.998。检测结果显示,该方法的灵敏度可达10 copies/μL或1 EID50病毒且特异性良好,除A型流感病毒外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪输血传播病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。对40份实验感染样品的检测结果表明,该方法与病毒分离结果一致,比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高,特异性更强。     

实时荧光定量RT-PCR方法检测禽流感病毒

根据禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)M基因上的保守序列,合成引物和荧光标记探针,以阳性AIVM基因质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应(RRT-PCR)检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度约为5拷贝/μL,相当于5个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为AIV检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。对500份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果阳性?阴性数与经典病毒分离方法符合率分别为91.2%?99.4%。在AIV临床样品筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链式反应检测方法的建立

参考GenBank登录的H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,利用DNAStar软件分析其同源性,利用Primer Premier5.0软件设计3对分别针对AIVH5、H7和H9亚型的特异性引物。3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228、830bp。结果显示,利用3对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。该方法对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228、830bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对H5、H7和H9亚型AIVcDNA的最低检出量分别为10-4、10-2和10-4。结果表明,本试验建立了可同时检测鉴别H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。     

Ultrasonic dyeing of cationized cotton fabric with natural dye. Part 2: Cationization of cotton using Quat 188

The dyeing of cationized cotton fabric with 3-chloro-2-hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride 69% (Quat 188) using Cochineal dye was studied using both conventional and ultrasonic techniques. Factors affecting dye extraction and dye bath exhaustion were investigated. The results indicated that the dye extraction by ultrasound at 300 W was more effective at lower temperatures and times than conventional extraction. Also, the colour strength values obtained were found to be higher with ultrasound than with conventional techniques. However, the results showed that the fastness properties of the dyed fabrics with ultrasound are similar to those of the conventional dyed fabrics. The scanning electron microscope (SEM) and X-ray diffraction (XRD) were measured for cationized cotton fabrics dyed with both conventional and ultrasound techniques, thus showing the sonicator efficiency.     

巴西橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因的克隆及序列分析

根据抑制性消减杂交文库分离的EST片段,采用3’-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得HbLEA14基因的全长cDNA序列,其ORF长456 bp,编码151个氨基酸,预测HbLEA14蛋白分子量为16.58 ku,等电点为5.10。同源性比对显示,HbLEA14与蓖麻RcLEA14、乳浆大戟EeLEA14、陆地棉GhLEA14、大豆GmLEA14、拟南芥AtLEA14、番茄SlER5的同源性分别为88%、80%、75%、73%、65%和61%,属于非典型第2组LEA蛋白。RT-PCR结果显示,死皮植株胶乳中HbLEA14的表达量明显高于健康树。     

油茶FatB基因全长cDNA的分离克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE等技术,获得了油茶FatB基因的全长cDNA克隆。RACE测序结果表明:油茶FatB基因不是一个单基因,而是一个多基因家族;用生物信息学的方法预测各RACE片段的起始密码子和终止密码子的位置,在起始密码子上游和终止密码子下游分别设计RT—PCR引物,RT—PCR扩增结合随机测序、生物信息学分析,分离克隆出5个基因家族成员,分别命名为co—fatb1、co—fatb2、co—fatb3、co—fatb4、co—fatb5,其全长CDS为1 272、1 311、1 305、1 305、1 263 bp,将上述基因序列提交至GenBank,登录号分别为FJ899670、FJ899671、FJ899672、FJ899673、FJ899674;最后,对油茶FatB的氨基酸序列的特殊位点进行了标识和分析。     

The relationship between cellular immune response to foot-and-mouth disease virus Asia 1 and viral persistence in Indian cattle (Bosindicus)

Foot-and-mouth disease (FMD), the most contagious animal disease, is associated with persistent viral infection in ruminants, despite the induction of systemic immune response. The present study was performed to decipher the relation between the persistent FMD virus (FMDV) infection and cellular immune response in Indian cattle (Bosindicus) following experimental inoculation of FMDV Asia 1. Persistent viral infection (carriers) was detected by antigen capture RT-PCR on the oesophageal-pharyngeal fluid. Viral excretion was found to be intermittent and strongly variable among the persistently infected Indian cattle. Lymphocyte proliferative (LP) response, assessed as reactivity of peripheral blood mononuclear cells to FMDV Asia 1 antigen (Ag) was of low magnitude indicating a weak primary cellular immune response following infection. LP response to FMDV Ag was higher among the non-carriers than carriers of FMDV Asia 1. An enhanced LP response was associated with the lack of virus shedding in the OPF. The findings of this study are suggestive of relationship between cellular immune response and virus excretion during persistence of FMDV Asia 1 in infected cattle.     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-6在不同发育时期的表达分析

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)是一类具有重要生理调控功能的蛋白酶超家族。为研究家蚕serpin-6基因(Bmserpin-6)在蚕体内的功能,利用半定量RT-PCR方法,分析该基因mRNA在家蚕不同发育时期的转录水平。Bmserpin-6基因在家蚕各个发育阶段均有表达,在4龄眠期、5龄6d、吐丝48h(化蛹前)和化蛹6d的转录水平较高,在5龄4d、吐丝初期和蛹末期的转录水平较低。Bmserpin-6基因在5龄期家蚕精巢和卵巢中的表达均呈现先下降后上升的趋势。研究结果表明,Bmserpin-6基因mRNA的转录具有明显的时空特异性,推测其在家蚕不同的变态发育期执行不同的功能。     

狂犬病病毒快速荧光RT-PCR检测方法研究与应用

采用TaqMan方法,根据古典狂犬病病毒非编码区及N基因编码区序列,设计合成多对引物和多条探针,通过对引物、探针的筛选,反应条件的选择和优化,建立了古典狂犬病病毒荧光RT-PCR检测技术。与病毒分离鉴定、常规RT-PCR试验比较表明,建立的荧光PCR检测技术快速、敏感,检测时限3 h以内。特异性试验表明本方法与犬瘟热病毒,犬细小病毒,犬Ⅰ型腺病毒不发生交叉反应。初步动物感染试验及定量检测研究及表明,本方法可用于感染动物不同组织样品中病毒的相对定量。对132份临床样品和4种商品化疫苗进行检测研究表明,本方法适用于样品中狂犬病病毒的直接检测以及疫苗中活病毒或灭活病毒的检测。