山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达

采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测.结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别.     

家蚕杆状病毒bro-d基因缺失对病毒基因转录和细胞凋亡的影响

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)bro (baculovirus repeated ORF)-d基因普遍存在于多种感染鳞翅目昆虫的多角体病毒基因组中,是杆状病毒中一类重复开放阅读框序列.为了解bro-d基因在病毒感染过程中的作用及其与宿主细胞凋亡之间的关系,本研究利用Red重组技术敲除BmNPV基因组中的bro-d基因,构建基因缺失型病毒bro-d-ko-Bacmid,并将该缺失型病毒转染家蚕BmN细胞,利用qRT-PCR技术检测bro-d基因的缺失对病毒基因组复制、转录水平以及抑制凋亡蛋白2基因(inhibitor of apoptosis protein 2,iap2)的影响.结果显示,bro-d基因缺失后会导致病毒基因组的复制水平显著下降(P＜0.05),同时病毒的早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p1O的转录水平也都显著下降(P＜0.05);iap2的转录水平显著下调(P＜0.05).在bro-d基因缺失型病毒的复制水平明显低于野生型病毒的情况下,仍会导致细胞活力显著下降(P＜0.05);bro-d基因缺失引起细胞B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)蛋白含量明显低于野生型病毒,而Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)含量显著高于野生型病毒(P＜0.05),进而导致细胞凋亡水平上升.结果表明,bro-d基因不仅对病毒各时期基因表达水平具有调控作用,也可通过调控iap2的表达进而调控宿主细胞的凋亡水平.研究成果为深入了解bro-d基因在病毒感染过程中的功能提供了基础资料,也为通过延长宿主细胞寿命、提高目的蛋白表达产量来进行杆状病毒表达载体的改造提供了新思路.     

Evaluation of a wettable powder formulation for the nuclear polyhedrosis virus of Anticarsia gemmatalis (Lep.: Noctuidae)

The influence of different carriers on the physical and biological stability of Baculovirus anticarsia wettable powder formulations was studied. The formulations were obtained by mixing the purified polyhedra of B. anticarsia with a carrier and drying the suspension in a bench spray dryer. Bioassays with Anticarsia gemmatalis Hübner showed that activity was maintained with the amorphous silica, attapulgite and kaolinite after a year of storage. In the presence of bentonite, activity declined 50% in the same period. All formulations, except kaolinite, maintained the physical parameters required of a good wettable powder. Kaolinite formulation showed reduction in wettability and particle agglomeration in storage. © 1997 SCI     

鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株S蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达及其免疫原性

为了对鸡传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)广西优势血清型代表株GX-YL5的S蛋白进行真核表达并研究其免疫原性,设计GX-YL5毒株S基因特异引物,扩增出目的片段后,构建重组表达载体pFastBacTM/HBM-TOPO-S,转化DH10Bac细胞获得重组杆...     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白主要抗原位点在昆虫细胞中的表达

用RT-PCR方法扩增届猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A、D,将其亚克隆至供体质粒pFastBacl,得到重组转移质粒pFastBael-TS1,转化到Escherichia coli DH5α中,提取阳性克隆质粒再转化到含穿梭载体bacmid的E.coliDHl0Bac中,发生转座作用,经蓝白斑筛选得到重组穿梭载体Bacmid-TS1,经PCR鉴定后再转染Sf9昆虫细胞,经空斑筛选得到纯化的重组病毒rAcV-Bac-FS1,经1FA、SDS-PAGE和Western-blot鉴定,重组杆状病毒TS1蛋白(相对分子质量约43 000) 在Sf9昆虫细胞中得到表达.     

表面展示鸡传染性支气管炎病毒M41株S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

以鸡传染性支气管炎病毒M41毒株基因序列为模板,利用PCR方法扩增膜定位信号缺失的S1基因(dS1),将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将S1及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBacTMDual,得到重组质粒pFastBac-gp64-dS1.将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组穿梭载体Bacmid-gp64-dS1,提取重组Bacmid质粒,以PCR验证其正确性.将阳性重组Bacmid质粒利用脂质体转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-dS1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以Sf9昆虫细胞膜表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白.     

百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1的表达及活性鉴定

为研究LHK1蛋白的功能,构建了pPub-LHK1∶AG-GFP和pFastBac-LHK1表达载体,分别在烟草叶肉细胞和昆虫细胞表达百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1跨膜蛋白。结果表明:在烟草和昆虫细胞中LHK1蛋白都能表达,且表达的蛋白在体外都能磷酸化底物(组氨酸转移酶HP1蛋白),具有组氨酸蛋白激酶活性。     

ORFV-Yulin株的分离鉴定及其B2L基因在昆虫杆状病毒系统中的表达

【目的】从榆林市具有典型羊口疮症状的陕北白绒山羊唇结痂病料中分离羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),克隆分析其B2L基因序列,并通过昆虫杆状病毒表达B2L基因。【方法】利用牛肾传代细胞进行ORFV的分离培养,通过PCR的方法从分离到的病毒中扩增出B2L全长基因,测序后进行序列及遗传进化分析。利用扩增所得的B2L基因构建昆虫杆状病毒表达载体,包装出杆状病毒后侵染sf9细胞,并通过SDS-PAGE、Western-blot以及质谱鉴定等方法验证目的基因的表达情况。【结果】成功分离出1株羊口疮病毒,命名为ORFV-Yulin株;扩增的B2L全长基因长度为1 137bp,与Hub13和GY-AHF10株亲缘关系最近,核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为99%和99.2%。通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了B2L基因,获得了47ku的重组蛋白。【结论】从榆林市陕北白绒山羊中获得了羊口疮病毒分离株(ORFV-Yulin);通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了ORFV-Yulin株的B2L基因。     

Identification of recombinant baculovirus and determination of virus titer with fluorescence quantitative PCR assay

AIM: To develop a real-time PCR assay based on TaqMan technology for the identification of recombinant baculovirus and determination of virus physical titers in Bac-to-Bac system.METHODS: The recombinant baculovirus containing human IL-18 gene was produced using Bac-to-Bac system.A 10-fold serially diluted primary viral stock was used for plaque assay and DNA extraction.Bacmid (baculovirus plasmid) was 10-fold serially diluted and served as standards.Real-time PCR amplification of the IL-18 gene was performed in triplicate for each diluted recombinant virus.At the same time,plaque assays were performed using overlay agarose method.RESULTS: The standard linear range (101 to 108 copies) for quantitation was achieved with the standard curve.We also find that the“vg/mL”titer value is generally about 10 times than“pfu/mL”titer of the same recombinant virus stock.CONCLUSION: A TaqMan real-time PCR method is established to identify the recombinant baculovirus and determine the“vg/mL”titer of virus.The method is rapid and quantitative over a wide range of virus titers.     

新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性

将新城疫病毒（四平株）F基因插入到pFastBac Ⅰ质粒中，构建了重组质粒pFF。pFF转化大肠杆菌DH10Bac后，F基因在助手质粒（helper plasmid)提供转座酶的情况下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid(re-Bacmid)。在含有X－gal/IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上，筛选白色菌落后，提取re-Bacmid转染Sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid经复制、表达、装配、形成重组杆状病毒，并表达F蛋白。经SDS－PAGE和Western-blot分析，表达的F蛋白的分子大小为63000，并证明在昆虫细胞内表达的蛋白能部分糖基化。表达的F蛋白约占细胞总蛋白的10％。动物试验证明，约建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性。