马铃薯晚疫病菌应答WRKY基因的结构功能预测与植物表达载体构建

WRKY是一类广泛参与高等植物各种抗逆调控活动的转录因子,可以通过激活下游相关信号转导途径调节自身的应激反应,进而增强植物抗逆性。本研究通过RNA-Seq从马铃薯(Solanum tuberosum)中筛选出一个晚疫病菌诱导WRKY转录因子基因StWRKY。采用RT-PCR技术获得该基因CDS全长,并对其进行序列分析及结构功能预测。根据StWRKY蛋白序列进行同源性搜索,得到与其蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列,使用MEGA7软件对St WRKY蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建了系统进化树。利用在线工具ProtParam对StWRKY进行氨基酸理化性质分析;利用SMART在线工具进行蛋白序列分析;利用SWISS-MODEL在线工具和PredictProtein在线平台分别对StWRKY蛋白二级结构和三级结构进行分析。结果表明,StWRKY核苷酸序列CDS全长为957 bp,编码含318个氨基酸的蛋白质,预测蛋白分子量为36.17 k D,等电点为6.49。既不是分泌蛋白也不是膜蛋白,未发现跨膜区、信号肽和复合螺旋区。StWRKY三维空间结构主要由无规卷曲以及β-折叠组成。通过XcmⅠ酶切、连接将StWRKY装载到pCXSN载体上,构建了该基因的超表达载体pCXSN-StWRKY。StWRKY基因的克隆,为进一步从分子水平上验证其抗晚疫病的生物学功能以及揭示马铃薯生物胁迫抗逆机制奠定基础,并为马铃薯抗病育种提供新的基因资源。     

利用SRAP分子标记技术鉴定大白菜种子纯度

以大白菜品种多抗3及其父母本为研究材料,利用SRAP（相关序列扩增多态性）分子标记方法,通过对54对SRAP标准引物的筛选,获得了能区分大白菜多抗3及其亲本的引物Me4F/Em3R。采Me4F/Em3R引物对对5份多抗3系列商品种子纯度进行检验,种子的纯度分别为75.5%、72%、80.5%、68%和73%,与田间种植纯度鉴定结果符合率分别为94.6%、89.3%、93.2%、95.5%和91.25%。说明利用SRAP分子标记方法对多抗3大白菜一代杂种进行快速、准确的纯度鉴定是可行的。     

长穗偃麦草EeSnRK2.6基因克隆及生物信息学分析

蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族2(SnRK2)基因家族受各种逆境胁迫诱导表达,在提高植物的抗逆性中发挥着至关重要的作用。为继续深入挖掘有效的抗逆相关基因资源并为转基因小麦提供重要候选基因,基于同源克隆方法从抗旱、耐盐性极强的长穗偃麦草中克隆了EeSnRK2.6基因的cDNA序列,该基因全长1 096bp,编码364个氨基酸,推测分子量为41.73kD,等电点为5.98,是亲水性氨基酸,共有18处磷酸化位点和1处跨膜域。氨基酸序列同源性分析发现,长穗偃麦草EeSnRK2.6基因与其他目前已报道的抗逆效果显著的SnRK2家族基因有较高同源性,同大豆SnRK2.6基因同源性达到95%,且具有典型的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶保守域。系统进化树分析表明,EeSnRK2.6与SbSnRK2.6属于同一进化分枝上。因此,推测该基因属于SnRK2基因家族成员,可能在参与逆境胁迫反应、增强植物的抗逆性中起着重要作用。     

爪哇稻Wanilava细胞质雄性不育系的创建及AFLP指纹图谱分析

初步鉴定了爪哇稻Wanilava细胞质雄性不育系的特征特性,并以2套水稻（Oryza sativa）同核异质材料273JW（爪哇型胞质不育系）、273D（D型胞质不育系）及其对应的保持系273B, 803JW（爪哇型胞质不育系）、803WA（野败型胞质不育系）及其对应的保持系803B为研究对象,利用AFLP 分子标记技术构建了JW型不育胞质的指纹图谱,分离了JW型胞质与野败型胞质及保持系的差异片段。     

麝香百合液泡膜水孔蛋白基因LlTIP2的克隆及生物信息学分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白,属于膜主要内在蛋白(major intrinsic proteins,MIP)超家族.采用RT-PCR和RACE法从麝香百合(Lilium longiflorum)叶片克隆得到1个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)基因的全长cDNA序列,命名为LTIP2(GenBank登录号:JN085950).该基因cDNA全长986 bp,包括208bp的3’-非翻译区,744 bp开放阅读框以及34 bp的5’-非翻译区,共编码247个氨基酸.由L1TI P2推导的氨基酸序列具有2个高度保守的水孔蛋白NPA (Asn-Pro-Ala)基序以及MIP的特征序列SGGHVNPAVTFG.同源性分析表明,LITIP2氨基酸序列与陆地棉(Gossypium hirsutum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦草(Lolium perenne)和小麦(Triticum aestivum)等植物TIP2的同源性分别达77％、74％、73％和72％.系统进化树分析表明LlTIP2属于液泡膜水孔蛋白TIP2亚类新成员.     

小麦条锈菌毒性变异与DNA多态性的相关性

为了解小麦条锈茵毒性和DNA多态性之间的相关性,为SSR标记技术在条锈茵群体遗传分析中的应用提供理论依据,对90个小麦条锈茵茵系进行了毒性和DNA多态性分析.毒性分析发现17种致病类型或生理小种,SSR分子标记分析发现75个基因型,DNA指纹的多态性远比毒性的多态性丰富.不同小种有相同或相近的DNA指纹,同一小种可能有不同的DNA指纹.毒性特征和DNA多态性之间并不存在相关性,SSR标记技术可用于小麦条锈茵群体遗传分析.     

大豆二核苷酸SSR侧翼序列保守性分析

从NCBI下载了大豆的EST和GSS序列,以SSR两侧序列各100 nt的片段作为分析材料,统计SSR数目、计算侧翼序列碱基组成,对SSR侧翼序列进行了序列比对和数据库blast搜索。结果表明:大豆SSR分布频率为1/6.67kb,侧翼序列GC含量为37.83%,二核苷重复是SSR的主要类型(65.7%),同一种重复基元的SSR存在多类型侧翼序列,同一类型的侧翼序列高度保守,不同类型的侧翼序列之间相似性较小,尤其是非SSR区域可以存在与SSR侧翼序列相同的序列。由上述结果推断SSR引物可能扩增出不含SSR的产物,易位可以产生形成新类型SSR。这一分析结果有助于提高SSR引物设计效率和进一步阐明SSR的形成机理。     

富集文库－菌落原位杂交法筛选栉孔扇贝的微卫星标记

应用微卫星富集文库─菌落原位杂交法,筛选得到了40个栉孔扇贝的微卫星标记.用固定了(AG)15和(AC)15探针的尼龙膜(Hybond N )捕捉含有微卫星DNA的片段,经洗脱、PCR扩增和TA克隆,构建栉孔扇贝的微卫星富集文库.利用ECL试剂盒(Amersham公司)标记的(AG)15和(AC)15探针进行菌落原位杂交筛选微卫星富集文库,阳性克隆经测序获得微卫星DNA.富集文库中1200个重组克隆经过菌落原位杂交后,532个(44.3%)为阳性克隆.任意挑选100个克隆测序,结果显示所有的克隆都至少含有一个微卫星位点.利用软件设计了65对特异性PCR引物,40对能扩增出清晰的带谱;利用48个栉孔扇贝个体评价微卫星位点,分析表明37个位点具有多态性.不同的位点获得的等位基因数目为2～14个不等,37个多态性位点共获得258个等位基因,平均每个位点获得7.0个等位基因.观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态性信息含量值(PIC)的范围分别为0.1000～1.0000、0.1197～0.9831和0.1172～0.9782.结果表明,富集文库─菌落原位杂交法适合大规模筛选目标物种的微卫星标记.     

凡纳滨对虾6个养殖群体遗传多样性的比较分析

中国多批次引进凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei并结合生产开展了相对独立的育苗工作,但对引进群体及引进后留种形成的本地群体的遗传变异水平缺乏了解,不利于种质管理及利用。此研究采用AFLP技术对抽查的6个养殖群体进行分析,发现进口群体具有相对较高的遗传多样性水平;养殖性能较好的东方、海星和旭明群体遗传多样性水平与进口群体相近;而乾塘群体遗传变异水平最高,推测可能是与其种质混杂有关;广益群体遗传多样性水平最低,可能已出现近交衰退。通过对各个群体间的遗传距离进行分析,为下一步根据亲缘关系的远近开展群体问杂交育种提供技术依据。     

Molecular typing of Streptococcus agalactiae isolates from fish

The genetic variability among Streptococcus agalactiae isolates recovered from fish was characterized using single-stranded conformation polymorphism (SSCP) analysis of the intergenic spacer region (ISR), and amplified fragment length polymorphism (AFLP) fingerprinting. A total of 46 S. agalactiae cultures isolated from different fish species and geographic origins as well as related reference strains were included in the study. ISR-SSCP divided the S. agalactiae isolates analysed into five distinct genotypes. Genotype 1 grouped all Kuwait isolates while genotype 4 clustered the majority of non-Kuwait isolates (USA, Brazil and Honduras). AFLP analysis offered a higher resolution level by dividing the isolates into 13 different genotypes. Two different AFLP profiles were identified within the Kuwait isolates. When data from both ISR-SSCP and AFLP were combined through a multidimensional analysis (MDS), a good correlation between geographical origin and genotypes was observed. Both AFLP and ISR-SSCP revealed genetic differences between S. agalactiae isolates from fish. While AFLP offered a higher resolution, ISR-SSCP also provided valid information being a simpler and faster method.