猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备及攻毒保护研究

为研究现用猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777疫苗毒株对流行毒株的免疫保护效果,以RTPCR进行PEDV CV777疫苗株、JS12流行株S基因克隆测序,进行PEDV S基因核酸序列分析与氨基酸序列分析。分别以转瓶工艺与细胞悬浮培养工艺培养Vero E6细胞,制备PEDV CV777株转瓶灭活苗与悬浮灭活苗。分别以PEDV转瓶灭活苗、悬浮灭活苗、PEDV流行株组织灭活苗(JS12株)产前30d免疫经产母猪;母猪产仔后14d进行仔猪攻毒保护试验。核酸序列分析显示,PEDV CV777株S基因与流行毒株的相似性在96.4%~99.7%之间,氨基酸序列相似性在96.7%~99.5%之间。转瓶工艺制备PEDV抗原效价为107.0 TCID50/mL,悬浮培养制备PEDV抗原效价为108.5 TCID50/mL。攻毒保护试验显示,悬浮灭活苗免疫母猪后,仔猪有2/10发病,保护率为8/10,转瓶灭活苗组发病率为8/10,保护率仅为2/10;组织灭活苗组9/10发病;对照组10头全部发病。该试验证明,提高PEDV CV777株的抗原含量,能够有效提高疫苗对PEDV流行毒株的保护效果。     

蚕豆黄化卷叶病的药剂防治

喷药治蚜防病试验中,溴氰菊酯和久效磷对豆蚜(Aphis craccivora)的防效分别达到96.7%和67.1%。两次和三次施用溴氰菊酯的防病效果分别达到84.1%和86.1%,蚕豆产量分别比未施药对照增产17.7%和21.9%。施药也影响蚕豆黄化卷叶病的时间分布型,三次施药小区的病株始终为泊松分布,病害没有再次扩散;未施药小区早春病株就出现负二项分布,越冬前病害已经扩散。豆蚜蚜害率与蚕豆黄化卷叶病发病率密切相关。     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株跨膜蛋白主要免疫决定区基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码跨膜蛋白主要免疫决定区(TMIR)的基因，并在大肠杆菌中进行了表达。所表达的融合蛋白有一部分是可溶的，其氨基端带有6个组氨酸的标签，因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化。在间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹试验中，重组的TMIR蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应，而与健康马血清无任何反应。这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性，可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制、接种马体内免疫应答及马传贫诊断的研究。     

黄瓜花叶病毒(CMV)2个山西分离物CP序列测定及亚组分类分析

 在生物学检测的基础上,利用酶联免疫检测、非序列依赖性PCR(sequence-independent amp-lification, SIA)对感病番茄进行分子鉴定,表现卷叶和花叶症状的番茄均被黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)侵染,分离物分别命名为SXFQ(GenBank登录号为JX993914)和FQ(GenBank登录号为JX993912)。为明确其分类地位,对二者外壳蛋白(coat protein, CP)进行克隆和测序分析。应用DNAMAN软件对本课题组前期检测的7个CMV山西分离物、SXFQ、FQ以及其他3个CMV典型分离物CP序列进行比较分析,发现核苷酸和氨基酸序列最大相似性分别为77.1%~100%和81.6%~100%。氨基酸序列系统进化分析表明,9个CMV山西分离物属于CMV亚组I B的2个分支,其中在指示植物上表现较强症状的SXFQ与其他5个分离物为一分支,在指示植物上表现较弱症状的FQ与其他2个分离物为另一分支。对9个山西分离物CP进行亚组分类分析,结果表明其理化性质、稳定性、疏水性与预测结果相近,2个分支的分离物分别出现相近的氨基酸变异和蛋白结构,存在一定规律性。     

通过病毒分离鉴定和基因检测首次发现虎流感

应用F81猫肾传代细胞，从高热、拒食和间有神经症状的死亡率病科中分离获得1株病毒，经形态学、理化学、生物学和血清学系统鉴定，证明为流感病毒。采用流感病毒核蛋白基因引物，对分离病毒及该虎病科进行RT－PCR扩增和序列分析，结果从分离病毒和虎病科中均扩增出与理论值大小相符的464bp基因片段；其序列与A、B、C3型流感病毒相比较，同源性分别为84．9％、35．0％、24．8％。由此说明，所分离病毒为A型流感病毒，命名为/蘧／哈尔滨（中国）／01／2002。用此分离病毒静脉接种于3月龄家猫3号，均出现与病虎相似的临床症状，其中1号耐过，2只死亡。死亡猫剖检变化与死虎相似，主要是呈肺炎病变，并可从病科中回收到所接种病毒。从此分离病毒为HA抗原，进行虎与猫血清的HI抗体检测，结果康复虎血清比其病初血清、康复猫血清比其接种前血清HI抗体均增高4倍以上，表明该病毒具有致病性，是引起该虎与试验猫发病甚至死亡的病原。     

Up-regulated expression of PD-1 and its ligands during acute Classical Swine Fever virus infection in swine

In order to investigate the relationship between the PD-1 pathway and impairment of immune responses with the CSFV infection, the mRNA expression of PD-1 and its ligands were evaluated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) during artificial CSFV infection. Simultaneously, expression of IL-2 and IL-10 mRNA were detected. The T cell proliferation and CSFV load in plasma were also measured. Results showed that the expression of PD-1 and its ligands mRNA were significantly increased (p < 0.01) in PBMC from 3 to 7 days post infection (dpi). Meanwhile the level of IL-10 was up-regulated (p < 0.01). The IL-2 mRNA was not obviously changed but it is significantly increased from 14 dpi. The T cell proliferation was notably decreased at 7 dpi. The CSFV load was also increased in plasma. Overall, our results suggest that the expression of PD-1 and its ligands were up-regulated and probably correlated with immune inhibition during acute CSFV infection.     

鸡法氏囊病毒重组多抗原表位串联肽的制备及其免疫反应

合成含有鸡法氏囊病毒抗原表位核酸序列的4条引物,利用SOE-PCR (重叠延伸PCR法)方法克隆得到含鸡法氏囊病毒多抗原表位串联肽的核酸序列。通过EcoR I和Sal I 两个酶切位点使该核酸序列插入原核表达载体(pET32a)。SDS-PAGE 实验结果表明鸡法氏囊病毒重组多抗原表位串联肽在大肠杆菌中的表达量为20%左右。Western blotting试验和免疫琼脂扩散沉淀试验（AGP）的结果均表明鸡法氏囊病毒重组多抗原表位串联肽具有明显的抗原性。     

玉米粗缩病(MRDV)的发生危害与防治对策

本文简述了玉米粗缩病(MRDV)的初侵染源、发病症状、发病原因和危害损失等情况。明确了玉米粗缩病(MRDV)的发生危害与环境条件、播种时期、品种抗病性差、自然界天敌减少等诸多因素有关。并提出了调整播期和以农业防治为主的综合防治措施等,就可以减少玉米粗缩病(MRDV)的发生与危害。     

RSV编码的4种蛋白在“AcMNPV-sf9昆虫细胞”体系中的重组表达

应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的4个基因NS2、NS3、CP和SP,并将它们克隆至pMD-18-T载体上.得到的重组质粒pMD-18-T-NS2、pMD-18-T-NS3、pMD-18-T-CP和pMD-18-T-SP经XbaⅠ/HindⅢ双酶切,分别与经相同方法酶切的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california nuclear polyhedrosis virus,AcM-NPV)转移载体pFastBacHTb相连接,构建重组转移质粒pFastBacHTb-X(pFastBacHTb-NS2、pFastBacHTb-NS3、pFastBacHTb-CP和pFastBacHTb-SP).序列测定表明,目的基因准确地插入到表达载体中.重组质粒pFastBacHTb-X通过转化包含有穿梭载体的大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH10Bac,得到重组穿梭质粒rb-X(rb-NS2、rb-NS3、rb-CP和rb-SP).rb-X侵染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)离体细胞(sf9)24-72 h后,在荧光倒置显微镜可见光200倍视野下观察到细胞增大、培养液和细胞内出现颗粒状物质、部分细胞破裂甚至裂解等一系列与正常sf9细胞形态有明显区别的现象.rb-X侵染细胞72h后,从细胞提取蛋白,电泳分析得到4个条带,大小分别为28.2、29.2、40.2和25.2 ku,与预测的4种融合蛋白大小一致.Western blotting分析分别得到4条单一条带,证明了RSV NS2、NS3、CP和SP基因在"AcMNPV-sf9昆虫细胞"真核表达体系中成功表达.