接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.     

番木瓜抗病突变抗PRSV基因的RAPD标记分析

利用随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphie DNA,RAPD)分子标记和集团分离分析法(Bulked segregation analysis,BSA)分析技术,对番木瓜(Carica papaya L.)F2代分离群体和抗番木瓜环斑型花叶病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)突变体LK-1的抗PRSV基因进行连锁分析,从250个随机引物中筛选出了与抗PPLSV基因相连锁的3个RAPD标记,连锁分析表明,S1366、S7058和S7125与抗PRSV基因(rys)的遗传距离分别为1.9 cM、2.4 cM和12.2 cM,其中S1366和S7058两个标记在抗PRSV基因的-侧,S7125在另-侧.     

PRSV-NIb基因同源dsRNA的原核表达及其在番木瓜叶片原生质体瞬时表达体系中诱导RNA沉默的研究

为探索利用PRSV-NIb基因同源dsRNA的原核表达产物在体外防治番木瓜环斑病毒的可行性,利用较保守的PRSV-NIb基因3’端的312、501和809 bp区段分别构建了含有PDK内含子的3个发夹RNA编码结构,并选用pSP73和M-Jml09LacY分别作为宿主载体和宿主菌构建了高效的dsRNA原核表达工程菌M-Jml09LacY/pSP73-RNAi-N312、M-Jml09LacY/pSP73-RNAi-N501、M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-N809,经IPTG诱导成功表达了dsRNA,并证明dsRNA不被DNase I和RNase A降解,稳定性较好.还利用PRSV-NIb基因构建了GFP瞬时植物融合表达载体pNIb-GFP,对经3种dsRNA和GFP瞬时融合表达载体共转化的番木瓜叶片原生质体的共聚焦显微镜观察及通过半定量RT-PCR对其中mRNA表达量的分析,结果表明融合基因NIb-GFP的表达均发生了不同程度的下调,说明dsRNA在原生质体中引发了针对同源基因的沉默.     

混合感染番木瓜PRSV/PLDMV株系基因组全长cDNA的克隆和实时荧光定量PCR分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)与番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)存在混合感染的现象,近年来混合感染发病率逐年递增,是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害。运用RT-PCR和RACE方法从混合感染样品中克隆获得2种病毒基因组全长c DNA,分别命名为PRSV-LM和PLDMV-LM,Gen Bank登录号分别为KT633943和KT633944,基因组序列大小分别为10 325、10 153 nt(不包括3′端的poly A)。序列分析表明:PRSV-LM与单独感染样品中的PRSV海南分离物HN(Gen Bank登录号:EF183499)的核苷酸序列和氨基酸序列相似性最高,为94%;PLDMV-LM与单独感染样品中的PLDMV海南分离物Hainan-DF(Gen Bank登录号:JX974555)核苷酸和氨基酸序列相似性最高,分别高达99%和97%。进化树分析显示,PRSV-LM和PLDMV-LM分别与单独感染样品的PRSV和PLDMV海南分离物有共同的进化起源。进一步利用实时荧光定量PCR对混合感染样品的PRSV与PLDMV病毒积累量进行分析,结果表明,混合感染样品中PLDMV病毒积累量大约是PRSV含量的100倍。研究结果为进一步探究PRSV/PLDMV混合感染发病机制奠定基础。     

番木瓜环斑型花叶病毒(PRSV)的为害特征及分子生物学

综述了番木瓜环斑型花叶病毒病(PRSV)主要为害特征、分子生物学特性及检测技术的相关研究进展。     

番木瓜抗PRSV育种研究进展与展望

综述了番木瓜抗PRSV性状遗传、分子标记辅助选择和抗PRSV育种等方面的研究进展,并对番木瓜抗PRSV育种存在的问题和前景进行了展望。     

Distribution and phylodynamics of papaya ringspot virus on Carica papaya in Cuba

Orchard and garden papaya crops grown in 47 Cuban municipalities were surveyed from 2008 to 2013, revealing the widespread distribution of papaya ringspot virus (PRSV) in Cuba. Phylodynamic analyses performed with the partial coat protein gene of all Cuban PRSV-P isolates (34 sequences) and 107 sequences of isolates from the American continent and the Caribbean islands showed a most recent common ancestor in 1942 (95% highest posterior density, HPD 95% = 1911–1967). The substitution rate was estimated to be 7.7 × 10⁻⁴ substitutions per site per year (HPD 95% = 4.6 × 10⁻⁴ to 1.1 × 10⁻³), which is equivalent to those detected in other RNA viruses. Demographic reconstruction of PRSV showed that viral diversity increased in the 1985–1990 period, which coincides with the implementation of extensive production practices. Moreover in Cuba, viral dispersion occurred from Mexico and other unknown ancestral locations. The spatiotemporal diffusion analysis proposed Mexico as an ancestral area for the origin of diversification in the American continent and suggests new dispersion events between American and Caribbean isolates. The observed widespread distribution, clear geographic grouping of Cuban isolates, virus growth and genetic diversity provide strong evidence of the PRSV dispersion patterns, which has implications for the control strategies of PRSV.     

番木瓜环斑病毒病综合防治

结合多年的番木瓜生产种植经验和新近的国内外番木瓜环斑病毒病的防治技术,对番木瓜环斑病毒病的防治进行了综述,提出了防治番木瓜病毒病的综合策略以及"病原—寄主"平衡调控的防治思想。     

抗环斑型花叶病毒病番木瓜新品种选育研究初报

用本地番木瓜品种(类型)与新引进的国外品种哥仑比亚(Colunbia)杂交获得杂交后代(F1),从中选择抗病植株再与抗病株系岭南1号杂交,初步选育出钟村1号等3个具丰产优质果实特性的优良抗病类型。接种试验及田间观察结果表明,钟村1号对3个株系病毒抗性均表现出较高水平,发病轻微,具有较强而稳定的水平抗病性。     

PRSV CP-VPg嵌合型ihpRNA干扰载体转化番木瓜的抗性分析

利用p CAMBIA3300载体为背景,构建PRSV CP-VPg嵌合型植物表达干扰载体p Cambia-hp RNA-CV,通过花粉管通道法将PRSV CP-VPg嵌合型植物表达载体遗传转化番木瓜,并将获得的转化番木瓜种子依次进行除草剂(PPT)筛选、PCR检测。结果表明:获得转基因番木瓜植株5株,且RT-PCR实验证明了目标片段在转基因株系中得到表达。采用人工摩擦接种法对转基因番木瓜株系进行攻毒实验,结果显示转基因番木瓜植株对PRSV病毒表现出抗病特性,说明hp RNA-CV成功的干扰了病毒基因的复制。该研究结果为番木瓜抗PRSV育种提供了一种有效的研究手段。