2株猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型分离株ORF4-7基因的克隆与序列分析

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）FJ0602和FJ0603株的ORF4～7基因进行了分段克隆、序列测定及同源性比较。结果显示,FJ0602和FJ0603株与LV核苷酸同源性为95．2％和95．3％,与VR2332核苷酸同源性为67．1％和66．9％,证实FJ0602和FJ0603株均为欧洲型PRRSV;与欧洲型弱毒疫苗株AmervacPRRSV有高度同源性,达到98．6％以上,提示分离毒PRRSVFJ0602和FJ0603株可能由疫苗株演化而来。FJ0602和FJ0603之间的核苷酸同源性为99．6％,表明这2毒株亲缘关系很近,很可能来源于同一毒株。     

2株猪圆环病毒ORF2基因的克隆测序

对分离到的2株猪圆环病毒PCV-2型的ORF2基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了2个毒株的ORF2基因阳性克隆。序列分析表明,这2个分离株与其他中国分离株同源性高达99%以上,同处于一个基因簇,但和中国BF分离株同源性却只有92.3%。而荷兰分离的NL-PMWS-2株与中国分离株的同源性却在99%以上,表明中国流行的PCV-2和国外分离株有密切关系。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆及其真核表达载体的构建

为了给猪圆环病毒2型的诊断和基因工程疫苗的研究奠定基础,试验根据GenBank中猪圆环病毒2型的核酸序列设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪病料组织中扩增出了ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pT-ORF2.结果表明:以重组质粒pT-ORF2为模板设计出1对引物,扩增出含ORF2主要抗原位点的区段566 bp,经Bam H Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pcDNA3.0,成功构建了重组表达质粒pcDNA3.0-ORF2.     

猪流行性腹泻病毒反向遗传学及其研究进展

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是高度接触性肠道传染病猪流行性腹泻（PED）的病原,是有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组全长约28 kb。2010年以来,PEDV G2型高致病性毒株不断发生变异,给全国乃至全球的养猪业造成巨大的经济损失。反向遗传学系统,即构建RNA病毒的全长感染性克隆。近年来,PEDV主要基于靶向RNA重组、BAC系统和体外连接3种方法来建立全长感染性cDNA克隆。文章简述了反向遗传学的原理和方法。靶向RNA重组利用冠状病毒RNA的高同源重组的特点来实现病毒的拯救;BAC系统利用pBeloBAC11载体克服PEDV基因组中含有的毒性序列所导致的cDNA在高拷贝质粒中不稳定的困难;体外连接技术主要利用PEDV基因组本身存在的限制性内切酶的酶切位点或通过改造的酶切位点在体外将病毒分片段地连接成全长的cDNA克隆。另外,文章还总结了近年来基于反向遗传学技术的PEDV相关的研究进展。PEDV反向遗传学是研究PEDV病毒基因组结构功能及设计减毒活疫苗的有效工具,利用反向遗传学技术探究S基因等毒力相关基因,探究其突变或缺失对病毒致病机制的影响,揭示PEDV毒力衰减的分子机制,有望设计出具有良好免疫原性且避免毒株返毒和重组减毒活疫苗。总之,PEDV反向遗传学是研究PEDV基因组结构及功能、病毒宿主相互作用及致病机制的一种重要方法,同时也是设计PEDV减毒活疫苗一种合理有效的途径。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的克隆及序列分析

参照已发表的猪圆环病毒II型(Porcinecircovirustype2,PCV2)基因序列,设计合成了一对引物,对PCV2北京株(Shy)ORF2基因进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约720bp的特异条带,将其回收后克隆入pGEM-TEasy载体中,并进行序列测定,与加拿大PCV2株(基因序列号AF027217)ORF2基因比较发现,核苷酸的同源性达99.3%,氨基酸的同源性为98.3%,证实为PCV2-ORF2基因。     

腹泻仔猪肠道病毒组学分析

为了解上海周边地区腹泻仔猪肠道病毒组学特征,特别是冠状病毒流行情况,采用病毒宏基因组学方法对6个猪场的90份疑似病毒感染导致腹泻粪样进行检测,并通过Geneious和MEGA7.0等生物信息学软件对获得的完整的α冠状病毒属中的PEDV ORF3基因序列进行遗传进化分析。数据显示,腹泻仔猪肠道病毒群落组成主要由小RNA病毒科(Picornaviridae)(63.67%)、星状病毒科(Astroviridae)(12.68%)、杯状病毒科(Caliciviridae)(4.07%)、细小病毒科(Parvoviridae)(2.51%)等组成。在唯一一个检测出PEDV阳性的猪场中,腹泻仔猪PEDV阳性率高达43.33%(13/30)。基因序列遗传进化分析显示,在本研究获得的3个PEDV ORF3基因序列中,有1个属于G2基因型,与其他参考PEDV病毒株相似性较高(96.44%～99.70%);另外2个ORF3基因序列属于G1基因型,相似性相对较低(95.11%～99.41%)。与PEDV传统株CV777蛋白序列比较分析发现,除piglet91株产生F2S突变以外,三株PEDV存在一致性突变,分别如下:V21A、I70M、V79I、F80V、L85I、L92F,这一特性,有可能是PEDV传统株与流行株基因型的鉴别依据。上海周边地区腹泻仔猪肠道病毒组成丰富,在不同猪群中,不同病原感染的情况有所差异,除了PEDV外,星状病毒和杯状病毒也是仔猪腹泻的主要病原。PEDV的ORF3基因与传统分离株相比具有独特的分子特征,新检测到的毒株突变位点与病毒毒力的关系有待于进一步研究。研究结果有助于了解腹泻仔猪肠道的病毒谱,并为仔猪病毒病防控提供一定的基础数据。     

猪流行性腹泻病毒ORF3基因的克隆及序列分析

为研究2015年重庆市荣昌部分腹泻猪场是否有猪流行性腹泻病毒的感染与流行,对猪流行性腹泻病毒ORF3(Open reading flame 3)基因进行克隆及序列分析研究。通过从疑似流行性腹泻病毒感染的猪场采集小肠组织,采用RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒的ORF3基因进行克隆。结果表明,所获得的ORF3基因ORF长675bp,编码223个氨基酸。通过DNAMAN软件分析,表明本研究中克隆的ORF3基因与CV777标准株(AF353511)的ORF3基因相似性为96.45%,与中国的NJ(KJ642645)的相似性最高,为99.41%,与attenuated DR13疫苗株(EU054930)相似性90.52%,而与CV777疫苗株(GU372744)相似性仅79.07%。系统进化树分析表明,该基因与中国毒株、韩国毒株以及美国分离株USA/Illinois 201/2014(KR265795)处于同一进化分支上,而attenuated DR13疫苗株、CV777 truncated疫苗株和欧洲的CV777标准株处于另一个进化分支上,说明该基因与中国毒株、韩国毒株的遗传距离最近。通过B细胞抗原表位预测分析,发现其氨基酸第65~68、114~116、137~140和150~154区域可能有潜在的优势抗原表位。成功克隆了猪流行性腹泻病毒ORF3基因,说明2015年重庆市荣昌部分腹泻猪场存在猪流行性腹泻病毒的感染。     

2019-2021年鸭坦布苏病毒广西流行毒株遗传多样性分析

【目的】研究鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)广西毒株分子遗传特征,以期了解、掌握DTMUV广西毒株流行新特点,为及时调整、制定有效防控措施提供数据支持。【方法】采集2019-2021年广西各地的鸭组织病料,采用已建立的实时荧光定量RT-PCR方法检测DTMUV,根据毒株检测年限和来源地选取部分阳性样品进行DTMUV全序列扩增及测序,并进行序列相似性、重要蛋白关键氨基酸位点、系统发育、全序列重组及遗传进化速率分析。【结果】共获得8株DTMUV全序列,基因组全长为10 992 bp,为广西毒株。广西毒株之间开放阅读框(ORF)及E、NS5基因的核苷酸序列相似性分别为97.9%~99.8%、97.0%~99.9%和97.8%~99.9%,氨基酸序列相似性分别为99.1%~99.9%、99.0%~100%和99.3%~99.9%;与国内外参考毒株的核苷酸序列相似性分别为86.4%~99.3%、85.8%~99.5%和87.1%~99.2%,氨基酸序列相似性分别为96.0%~99.8%、94.8%~100%和97.5%~99.9%,且与水禽源TMUV相似性高于其他宿主源。与疫苗株FX2010相比,DTMUV广西毒株E蛋白共有11个氨基酸位点发生变异,其中第43、150、153、326、403、464及487位为广西毒株独特的氨基酸突变。ORF遗传进化分析结果显示,广西毒株均分布于2.1亚群,而源自广西的GX2011和GX2015株隶属于2.2亚群,表明DTMUV广西流行毒株进化趋势不完全一致;E、NS5基因系统发育趋势与ORF相似。重组分析结果表明,GXBH01-2019、GXZS02-2020、ziYY150901及HB2016株检测有重组信号。E、NS5基因的遗传进化速率估算分别为1.31×10^-3和1.30×10^-3替换/(位点·年),表明二者进化较为同步。【结论】当前DTMUV广西流行毒株表现为与主要流行毒株亲缘性较近,E蛋白发生特有氨基酸突变,进化趋势不一致,存在重组现象等分子特征,结果为制定有效防控措施提供了基础数据。