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21.
猪IL-2真核表达质粒构建及对PRRSV-ORF5基因疫苗免疫佐剂作用的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究应用真核表达载体pcDNA3.1(+)和猪白细胞介素2(IL-2)基因成功构建了IL-2的真核表达质粒(pcDNA-IL-2),探讨了pcDNA-IL-2作为分子免疫佐剂对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)ORF5基因疫苗(pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5)免疫猪的增强作用。经间接ELISA法、MTT比色法及流式细胞仪分别对pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫猪、pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5单独免疫猪、pcDNA3.1(+)空载体和灭菌水免疫对照猪的血清抗PRRSV抗体IgG、外周血T淋巴细胞的增殖活性、CD4^+和CD8^+细胞比例进行检测,结果表明pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫猪的IgG含量、外周血T淋巴细胞的增殖活性、CD4^+和CD8^+细胞比例与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5单独免疫猪相比有显著差异(P〈0.05)。说明pcDNA-IL-2能显著增强pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5基因疫苗免疫猪的体液和细胞免疫应答,可作为PRRSV基因疫苗的良好佐剂。 相似文献
22.
本研究对我国华东地区猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)分离株S1主要结构蛋白基因(ORF5~7)进行了PCR扩增和DNA测序分析。结果表明,长度为1520bpDNA序列含有3个阅读框ORFs,即ORF5、ORF6和ORF7,ORF5和ORF6及ORF6和ORF7间有部分碱基重叠,且与欧洲型和美洲型PRRSV相似。ORFs推导的氨基酸序列与美国VR2332和欧洲LV毒株同源性分析为99%~100%和59%~78%。ORFs预测的蛋白质分子量、等电点、糖基化位点、亲水性分布图及跨膜螺旋区与VR2332毒株相似。 相似文献
23.
[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒(Goose astrovirus 1,GAstV-1)结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1:128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。 相似文献
24.
ZHOU Yu-zhao MA Zhi-liang SUN Ting-ting YANG Jie ZHANG Xiao-miao CHAI Jun ZHANG Na-na ZHANG Yi-fang 《中国畜牧兽医》2015,42(11):2880-2887
The present study was designed to construct recombinant plasmids,which could express porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) ORF5 gene.RNA was extracted from spleen and lung samples of the suspected pigs which were infected with PRRSV.According to PRRSV ORF5 gene,a pair of primers was designed for RT-PCR amplification.The ORF5 target gene was cloned into pMD19-T vector and then the recombinant pMD19-ORF5 was achieved.According to the sequencing results and the characteristics of expression vectors,a pair of primers with NcoⅠand XbaⅠenzyme cleavage sites was designed.Target fragment dORF5 was amplified and then connected to pProEXHTb and pNZ8149 vectors,respectively.And recombinant HTb-dORF5/DE3 and pNZ8149-dORF5/NZ3900 was induced by IPTG and Nisin,respectively,and analyzed by SDS-PAGE and Western blotting.Recombinant HTb-dORF5/DE3 induced by 1.5 mmol/L IPTG was expressed in the highest quantity.There were specific band at about 22 ku with reactionogenicity when it was tested by SDS-PAGE and Western blotting.Recombinant pNZ8149-dORF5/NZ3900 induced by 20 ng/mL Nisin was expressed in the highest quantity.There were specific band at about 19 ku with reactionogenicity when it was tested by SDS-PAGE and Western blotting.The IFA result showed specific green fluorescence.This study successfully constructed recombinant plasmids HTb-dORF5 and pNZ8149-dORF5 and expressed,the result laid a solid foundation for further development of PRRS vaccines. 相似文献
25.
采用RT-PCR方法对2009—2011年山西省分离的5株猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的ORF5和Nsp2(2503~3269nt)基因进行克隆和测序,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果显示,5株分离株Nsp2基因与国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)的序列同源性最高,为96.8%~98.2%,且缺失位置一致,均存在2个位点30个氨基酸缺失;ORF5基因大小为603bp,编码200个氨基酸,第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R),137位为丝氨酸(S),表明这5株均为野毒株,与国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)毒株的序列同源性最高,为96.5%~98.0%。结果表明,山西省内目前流行的PRRSV为Nsp2缺失30个氨基酸的变异毒株。 相似文献
26.
为研究、防控广东地区猪流行性腹泻,首先通过RT-PCR法确定某猪场粪便样品中存在猪流行性腹泻病毒,随后利用Vero细胞进行盲传,最后经核酸类型鉴定、RT-PCR、病毒TCID50的测定、目的基因测序和序列分析等方法,确认分离到2株猪流行性腹泻病毒毒株,命名为PEDV GDKP-2013和PEDV GDKP2-2013,通过ORF3全基因核苷酸序列分析可知,GDKP-2013株与GDKP2-2013株与经典参考毒株的氨基酸序列一致性为 JX261936-CHGD-01,98.2%,98%;JQ039903-CH-GD-2011,98.6%,98.4%;AF353511-CV777,95.4%,95.1%;KC344845-STPED0810,95.1%,94.8%;EU054929-DR13,95.5%,95.2%;KF272920-USA-Colorado-2013,95.1%,94.8%,表明此2毒株与国内分离株的氨基酸同源性高,与韩国、泰国和美国分离株的氨基酸同源性要低一些,同时,与疫苗参考株的氨基酸同源性也相对较低;基因系统进化分析可知,GDKP-2013株与GDKP2-2013株主要处在Ⅰa分支,均与弱毒疫苗株(Ⅰb分支)相互之间遗传进化关系较远。 相似文献
27.
Cellular immune responses of BALB/c mice induced by intramuscular injection of PRRSV-ORF5 DNA vaccine with different doses 总被引:1,自引:0,他引:1
Anchun Cheng Mingshu Wang Xiwen Chen Nigen Xini Wenbo Dou Xuemei Li Wumei Liu Gang Wang Pingying Zhang 《Frontiers of Agriculture in China》2007,1(1):105-110
BALB/c mice were immunized with 50 μg, 100 μg, 200 μg of pcDNA-PRRSV-ORF5 DNA vaccine respectively by intramuscular injection,
with PBS and pcDNA3.1(+) as controls. Fluorescence activated cell Sorter (FACS) was used to detect the number of CD4
+ and CD8
+ T-lymphocytes. T-lymphocyte proliferation test was used to detect proliferation of the T-lymphocyte cells in peripheral blood
lymphocytes of mice vaccinated with pcDNA-PRRSV-ORF5 DNA vaccine. The results showed that the difference in ConA response
to T-lymphocytes in blood was highly significant between all experimental groups and the control group (P < 0.01). The number of CD4
+ T-lymphocytes in experimental groups was significantly higher than that of the control group 7 d after vaccination. The number
of CD8
+ T-lymphocytes in the experimental groups was higher than that of the control group 28 d after vaccination. Mice immunized
with a higher dose (200 μg) of DNA vaccine demonstrated higher cellular immune response than those immunized with a lower
dose (100 μg, 50 μg) of DNA vaccine. The results demonstrated that pcDNA-PRRSV-ORF5 DNA vaccine could induce a good cellular
immune response which may be dose-dependent.
__________
Translated from China J Vet Sci Mar, 2006, 26(2): 111–114 [译自: 中国兽医学报]
The first three authors contribute equally to this work. 相似文献
28.
合成一对猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)ORF1基因特异性引物,对分离到的郑州分离株(ZZ株)猪圆环病毒PCV-2型的ORF1基因进行了扩增,经测序后,将所测序列与已公布的35株PCV-2ORF1序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株间的ORF1基因核苷酸同源性为97.3%~100%;进化树分析表明各分离毒株ORF1基因在进化上比较保守。同时对PCV-2OFR1部分功能进行分析,发现该基因蛋白具有良好的抗原性。 相似文献
29.
融合表达猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因真核质粒的构建及对小鼠的免疫原性 总被引:2,自引:0,他引:2
用PCR法扩增出猪圆环病毒2型的Rep蛋白基因(933bp)和Cap蛋白基因(705bp),将其定向克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点上,构建真核表达质粒pcDNA-ORF1-ORF2。将构建好的重组质粒pcD-NA-ORF1-ORF2按100μg/只腿部肌肉注射BALB/c小白鼠,同时设pcDNA-ORF1、pcDNA-ORF2、pcDNA3.1-(+)、PCV2全毒疫苗和PBS为对照,共免疫2次,间隔2周。分别于首免后第0、7、14、21、28、42天用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖效应,用ELISA法检测小鼠的抗体水平;并于首免后第0、7、14、21、28天测定脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例,对该核酸疫苗的免疫原性进行初步评价。结果显示,重组质粒能诱导鼠体产生较强的细胞免疫和体液免疫,并从免疫后第7天起所测各组数据均显著高于(P〈0.05)或极显著高于(P〈0.01)其他试验组。结果表明,将ORF1和ORF2基因共同用于PCV2核酸疫苗的研发具有很好的前景,为研究新型猪圆环病毒疫苗奠定了基础。 相似文献
30.
设计1对针对猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组的特异性引物,从疑似断乳仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后构建重组质粒pMD18-T Simple-PCV2(命名为P-S-PCV2)。用ORF9特异的限制性内切酶Bpu10Ⅰ对P-S-PCV2进行酶切、补平连接反应,构建了ORF9基因缺失突变的重组质粒(命名为P-S-PCV2-J)。用SacⅡ对基因缺失突变的重组质粒进行酶切,获得的线性化基因突变PCV2基因组在体外进行自身环化,形成了相应缺失基因DNA(命名为PCV2-J)。用PCV2-J缺失突变株进行细胞转染、动物致病性和免疫原性、T淋巴细胞亚群的动态变化等部分生物学特性的研究。结果显示:PCV2-J转染IBRS-2细胞后,电镜观察可见病毒颗粒,PCR-RFLP检测有突变株生长;PCV2-J接种仔猪后无临床典型大体病变,PCR-RFLP检测淋巴结中有PCV2-J突变病毒的感染;PCV2-J免疫仔猪后的抗体水平在第2周开始上升,与对照组相比差异显著,CD3+下降,与对照组无差异,CD4+下降,第1周与对照组差异显著,CD8+与对照组差异不显著。结果表明,ORF9基因缺失突变的PCV2仍具有复制感染能力,但免疫原性减弱。 相似文献