6种杀虫剂对旱稻孢囊线虫孵化的影响

为明确水稻常用杀虫剂对旱稻孢囊线虫孵化的影响,在室内条件下测定了毒死蜱、三唑磷、灭线磷、丙溴磷、阿维菌素和杀虫双等6种杀虫剂在不同浓度和时期处理对旱稻孢囊线虫的作用效果。结果表明,6种杀虫剂中丙溴磷、毒死蜱、阿维菌素对旱稻孢囊线虫的孵化具有较高的抑制活性;药剂长期处理对2龄幼虫孵化的抑制效果最好,刚分离的孢囊较预先孵化7d后的孢囊对药剂的敏感性低;三唑磷和灭线磷在较低浓度范围内对孢囊线虫的孵化具有刺激作用。研究结果可为制定旱稻孢囊线虫防治措施提供依据。     

基于线粒体DNA-COI序列的禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测

【目的】设计禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）和菲利普孢囊线虫（Heterodera filipjevi）特异性引物,建立同步快速检测这两种线虫的双重PCR体系,为中国小麦孢囊线虫（cereal cyst nematodes,CCN）的田间快速诊断与综合治理提供技术支持。【方法】通过比对分析10种植物寄生线虫24个群体的线粒体DNA（mtDNA）COI序列,分别设计并筛选禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的上游特异性引物HaF8和HfF9,以及下游通用引物HafR8;通过引物浓度比和退火温度的优化,建立针对这两种CCN的双重PCR检测体系;利用该体系对中国黄淮麦区部分CCN样品进行种类鉴定。【结果】筛选并获得的特异性引物HaF8/HafR8及HfF9/HafR8,可在一步PCR反应中实现对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的特异性检测。引物HaF8/HafR8对禾谷孢囊线虫的特异性扩增产物为200 bp,而HfF9/HafR8对菲利普孢囊线虫的特异性扩增产物为320 bp,条带区分较明显。对双重PCR检测体系的优化发现,引物HaF8、HfF9、HafR8的退火温度为58℃时,该检测体系具有较高的特异性和扩增效率;引物HaF8﹕HfF9﹕HafR8浓度比为0.24﹕0.16﹕0.4 μ·L^-1时,该检测体系能从不同供试线虫中同时特异性地检测出禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫,且扩增效率较高。该检测体系对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫单孢囊的检测灵敏度为1/2 000 000个孢囊,而对2龄幼虫的检测灵敏度则分别为1/640条线虫和1/1 280条线虫。对采集自中国黄淮麦区CCN病田的14份土样进行双重PCR检测,发现有8个样本只扩增出200 bp的条带,表明这些样本的CCN种类为禾谷孢囊线虫,有4个样本只扩增出320 bp的条带,表明CCN种类为菲利普孢囊线虫,2个样本同时扩增出200和320 bp两个条带,表明样品为禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的混合发生。以上结果表明,该检测体系可以成功用于两种小麦孢囊线虫田间复合侵染情况的快速诊断。【结论】基于mtDNA-COI序列开发的特异性引物以及建立的双重PCR检测体系,可用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫田间单一和混合发生样本的同步快速检测。     

Development of an ISSR-derived PCR marker linked to nematode resistance (Ha2) in spring barley

Cereal cyst nematodes ( Heterodera avenae Woll.) are economically damaging barley parasites in most cereal growing areas of the world and the development of resistant cultivars is the best measure against the pathogen. An ISSR (inter-simple sequence repeat) marker identified as closely linked with the H. avenae race 1 and 2 resistance gene ( Ha2 ) has been converted into a codominant sequence characterized amplified region marker ( Ha2S18 ) and mapped in barley 'SW Buddy' × 'SW Cecilia' DH population at 4.3 cM from the Ha2 locus on the long arm of chromosome 2H. The potential usefulness of Ha2S18 in large scale marker assisted selection schemes has been evaluated in a broad genetic background and is an important complement to the bioassay and to other linked DNA-markers for this trait.     

Heterodera filipjevi许昌群体SCAR标记的建立

菲利普孢囊线虫Heterodera filipjevi是禾谷类作物上重要的病原线虫之一,严重影响禾谷类作物的产量和品质。本课题组前期研究发现菲利普孢囊线虫许昌群体是一个新的致病型,其在小麦上的致病力强于其他多个群体,危害更为严重。本研究旨在建立菲利普孢囊线虫许昌群体的快速、准确的分子检测体系,为Heterodera filipjevi许昌群体的监测和防控及抗病品种的选育利用奠定基础。本研究采用随机扩增多态性DNA(RAPD)和序列特征扩增区域(SCAR)的方法,对黄淮麦区5个重要小麦孢囊线虫致病型共9个线虫群体进行RAPD分析和SCAR标记转化,并通过增加除黄淮麦区外的线虫群体验证所获得的致病型相关分子标记的特异性和有效性。本研究共筛选了331条RAPD引物,筛选出2个菲利普孢囊线虫许昌群体相关的RAPD标记,引物S86可以扩增出1条约550 bp的多态性片段,引物S178可以扩增出1条约1 200 bp的多态性片段,并将这2个RAPD标记成功转化为SCAR标记。SCAR标记的特异性检测结果表明这两个SCAR标记只在许昌群体上有特异性扩增,可以用于许昌群体的分子检测。     

大豆孢囊线虫扩展蛋白新基因(Hg-exp-1、Hg-exp-2)的鉴定及功能分析

【目的】大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)是大豆上最重要的土传病原物之一,由孢囊线虫口针分泌的扩展蛋白(expansin)在线虫侵染过程中发挥了重要作用。本研究旨在鉴定大豆孢囊线虫扩展蛋白基因,并对其结构、组织定位和发育表达特性进行研究,为进一步明确大豆孢囊线虫的寄生、致病机制打下基础。【方法】利用同源基因克隆技术,根据已报道的线虫expansin基因的保守序列设计上下游简并引物,从大豆孢囊线虫2龄幼虫cNDA中克隆expansin基因的EST片段,根据EST片段序列设计RACE特异性引物,通过RACE技术扩增测序后采用DNAstar 7.1和DNAman软件对序列进行比对和拼接,得到大豆孢囊线虫expansin基因c DNA全长;采用CLC sequence viewer 6进行开放阅读框查找、蛋白质翻译和序列比对;使用EBI在线软件Signal P 3.0 Server和TMHMM软件进行预测蛋白质前体信号肽和跨膜结构域预测,GSDS在线软件进行基因组结构分析;使用PHYML软件和MEGA5.0软件最大似然法对获得的基因与其他线虫expansin基因进行比对与系统进化树构建;采用Southern杂交技术分析Hg-exp-1在大豆孢囊线虫基因组中的拷贝数;通过原位杂交技术确定2个expansin基因的表达部位;提取卵、侵染前2龄幼虫、侵染后2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫与白雌虫的c DNA作为模板,通过半定量PCR技术分析expansin基因在线虫不同龄期的发育表达特性;根据Hg-exp-1基因序列设计引物扩增并合成dsRNA,对大豆孢囊线虫2龄幼虫浸泡处理24 h后接种大豆植株,分析Hg-exp-1 RNA干扰后对线虫侵染的影响。【结果】从大豆孢囊线虫2龄幼虫中成功克隆出2个扩展蛋白基因全序列,命名为Hg-exp-1和Hg-exp-2,长度分别为1 047和1 037 bp,分别编码长度为288和295个氨基酸的多肽,2个预测蛋白N端均含有信号肽,无跨膜结构域,表明其为分泌型蛋白。序列比对发现大豆孢囊线虫HG-EXP-1序列与马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)GR-EXPB1(CAC83611)和GR-EXPB2(CAC84564)以及非洲茎线虫(Ditylenchus africanus)DA-EXPB1(ADJ57307)等具有高度一致性。Southern杂交分析表明,expansin基因在大豆孢囊线虫中可能以多拷贝方式或多基因家族存在。原位杂交显示它们特异地在大豆孢囊线虫亚腹食道腺表达。Hg-exp-1体外RNA干扰后,2龄幼虫浸泡在dsRNA 24 h,靶基因的转录水平下调,接种后大豆根内线虫2龄幼虫数和雌虫数分别下降了38.3%和43.4%。【结论】从大豆孢囊线虫中成功分离鉴定出2个expansin基因,同时明确了其在大豆孢囊线虫寄生早期过程中起重要作用。     

胶东地区不同麦田燕麦孢囊线虫群体发生量比较及差异分析

为探讨2015年燕麦孢囊线虫(Heterodera avenae,Ha)在胶东麦田的发生状况,在莱阳和即墨样田对Ha定点和定期取样,通过土壤中线虫分离和根组织中线虫染色后镜检,测定不同时期Ha各虫态群体密度及其动态变化.结果表明,在Ha 2龄幼虫土壤孵出量和根系侵入量上,莱阳样田均是即墨样田的1.4倍;在3龄幼虫和4龄幼虫发育量上,莱阳样田分别是即墨样田的1.8倍和1.7倍;在白色雌虫产生量上,莱阳样田是即墨样田的39倍;在Ha繁殖系数上,莱阳样田是即墨样田的6.5倍.有迹象表明,更加严重的土壤干旱状况是导致即墨样田Ha繁殖系数极其低下的原因.     

禾谷孢囊线虫果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1的鉴定与表达特征分析

【目的】禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是一种严重危害麦类作物的重要植物病原线虫,对农业生产造成巨大的经济损失,然而其致病机制和有效防控方法还有待进一步研究。通过克隆禾谷孢囊线虫的果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1,并对其表达特性进行分析,为后续探究Ha-pel-1的基因功能及其与寄主的互作提供理论依据,并为探讨禾谷孢囊线虫防控途径提供新思路。【方法】采用同源克隆结合RACE技术从禾谷孢囊线虫中克隆出一个新的果胶酸裂解酶基因;采用DNAMAN、Clustal、Signal P 4.0 Server和GSDS等相关生物信息学软件和在线工具分析该基因的核苷酸和氨基酸序列,并使用MEGA 5.0构建系统进化树;采用原位杂交和半定量PCR方法确定该基因的在禾谷孢囊线虫中的表达部位及其在线虫不同龄期中的表达情况。【结果】从禾谷孢囊线虫中成功克隆出一个果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1(Gen Bank登录号GQ998895),该基因c DNA全长1 717 bp,包含一个长度为1 563 bp的开放阅读框,编码一个长度为521个氨基酸残基的蛋白,其理论分子量为57.5 k D,理论等电点为8.52。从线虫基因组DNA中扩增获得长度为7 199 bp的Ha-pel-1基因组全长,基因结构显示分析发现,Ha-pel-1基因组包含14个外显子和13个内含子,除第3个内含子剪接位点是GC-AG外,其余12个内含子都符合真核生物基因剪接位点GT-AG规则。同源比对结果表明,预测蛋白Ha-PEL-1的C端与大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶HG-PEL-1、甜菜孢囊线虫果胶酸裂解酶HS-PEL-1均有67%的一致性和83%的相似性;此外,其N端信号肽后比报道的其他植物寄生线虫果胶酸裂解酶多出一段长度为254个氨基酸残基的序列,这段序列中,靠近N端的184个氨基酸残基与数据库中的蛋白均无相似性,而靠近C端有70个氨基酸残基(Lys205—Glu274)与韦塞尔斯布朗病毒NS5蛋白(注册号3ELD)的甲基转移酶区域有32%的一致性和47%的相似性。氨基酸序列分析发现,预测蛋白Ha-PEL-1包含一个长度为20个氨基酸残基的信号肽和4个果胶酸裂解酶第3家族(PL3)的高度保守区域以及多个保守的半胱氨酸残基;系统进化分析发现,Ha-pel-1及其他已报道的线虫果胶酸裂解酶基因与细菌和真菌来源的PEL聚在一个大的分支中;原位杂交结果显示Ha-pel-1主要在禾谷孢囊线虫亚腹食道腺中表达;半定量RT-PCR确定Ha-pel-1在寄生前和寄生后的2龄幼虫中大量表达。【结论】通过对禾谷孢囊线虫中一个新果胶酸裂解酶基因Ha-pel-1的克隆和表达特征分析,揭示该基因与禾谷孢囊线虫的侵染和寄生过程密切相关。     

Assessment of parasitic fungi for reducing soybean cyst nematode with suppressive soil in soybean fields of northeast China

Experiments were conducted to study the inhibitor factors present in suppressive soil that suppressed the soybean cyst nematode (SCN) in the black soil fields with 21 years continuous cropping of soybean (SSSS) and 3 years continuous cropping of soybean followed by 1 year corn (SSSC). Compared with the SSSC field, the densities of SCN significantly (P?Fusarium equiseti, Pochonia chlamydosporia and Purpureocillium lilacinum were isolated from cysts, eggs and J2 of SCN and soil in SSSS and SSC field. The population density of these parasitic fungi was significantly (P?P. chlamydosporia was higher than other fungi. Real-time PCR was used to test genomic DNA of P. chlamydosporia in SSSS and SSC field soil. The mass of genomic DNA and the population density of P. chlamydosporia were significantly (P?P. chlamydosporia, may play an important role in the suppression of SCN population in the suppressive soil.     

拮抗大豆胞囊线虫根瘤菌的研究

对传统筛选生防根瘤菌的方法进行了改良,建立一种新的生防根瘤菌筛选体系—半根瘤法。利用此法结合根瘤菌回接结瘤鉴定,从全国7个省市土样诱集到的根瘤中,筛选出23株根瘤菌。分别测定其菌悬液、发酵液对大豆胞囊线虫J2的作用。结果表明:处理48 h后,5株根瘤菌菌悬液及发酵液对大豆胞囊线虫J2具有较高击倒率,分别为Snb21、Snb53、Snb92、Snb166和Snb711;处理72 h后,菌株Snb166和Snb711对大豆胞囊线虫J2具有较高致死活性,其中Snb166发酵液72 h处理J2致死率最高,达到84.27%。     

大豆抗胞囊线虫的抗病育种及抗病基因的研究进展

大豆胞囊线虫病是世界大豆生产上的重要病害,给大豆生产造成巨大损失,种植抗病品种是防治大豆胞囊线虫病最经济有效的措施,国内外在大豆抗胞囊线虫病育种领域取得了较大进展。文中从抗胞囊线虫的抗源筛选、抗病育种和抗病基因3个方面综述了国内外的研究进展。