伪狂犬病毒GDSH株的分离鉴定及gE基因的序列分析

从广东四会某猪场分离到一株疑为猪伪狂犬病病毒(PRV)的病毒,病毒在猪肾细胞上出现细胞变圆、拉网、融合等典型病变,并具有细胞泛嗜性特点。在MDCK细胞上测得其TCID50值为10-8/0.1mL,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。将0.1mL病毒液接种小鼠后发生奇痒并麻痹致死,接种猪3天后发病,7天死亡,从攻毒病死猪的脑组织病理切片上观察到典型的病毒性脑膜脑炎及血管套现象。通过PCR扩增到PRVgD基因,由此进一步证明所分离病毒为猪伪狂犬病毒,并命名为GDSH株。根据GenBank中发表的序列,设计一对扩增PRVgE基因的特异性引物,建立可以区分PRV野毒株与疫苗株的PCR诊断方法。以此方法对病毒的细胞培养液进行检测,结果证实所分毒株为PRV野毒株,经克隆测序后与GenBank收录的其它PRVgE基因序列进行比较,发现所测毒株的核苷酸序列与其它PRV毒株的同源性介于98.3%～99.9%之间,其中与PRVEa株的亲缘关系最近为99.9%。     

葡萄MADS-box家族基因保守片段的克隆与序列分析

MADS-box转录因子在多种植物的发育过程特别是花器官和果实发育过程中发挥重要的作用。为了从葡萄中克隆出新的MADS-box基因,研究在葡萄花及果实发育中的作用,根据多种植物MADS-box基因保守区序列,设计简并引物,应用RT-PCR技术从红富士葡萄花序中分离出34条MADS-box基因cDNA片段。序列分析表明,这些片段长度在138～152bp之间,包含基因起始密码子。推导的氨基酸序列与已登录的欧洲葡萄及其它物种的MADS-box基因同源性超过83%。用推导的氨基酸序列与已知的欧洲葡萄和拟南芥MADS-box家族基因进行系统发育分析,可将这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,证明葡萄中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因。     

蓖麻蚕核型多角体病毒p6.9基因的克隆及序列分析

基于丰富蓖麻蚕核型多角体病毒(Philosamia cynthia ricininucleopolyhedrovirus,PcrNPV)分子信息的目的,对PcrNPV DNA部分片段进行了测序分析,获得1个DNA结合蛋白基因p6.9的完整序列。该基因的读码框由240个核苷酸组成,编码79个氨基酸,分子质量约为9.8 kD,转录起始位点ATG侧翼序列符合Kozak规则,其上游34bp处具有晚期基因转录的保守起始序列taag,表明该基因为晚期表达基因。将PcrNPV与12种昆虫核型多角体病毒P6.9蛋白氨基酸序列作同源性比较的结果显示:PcrNPV P6.9蛋白氨基酸序列与家蚕(Bombyx mori)NPV P6.9的同源性为59%,与柞蚕(Antheraea pernyi)NPV的同源性为100%,表明PcrNPV与ApNPV的亲缘关系很近。     

Occurrence and characterization of gastric Helicobacter spp. in naturally infected dogs

Helicobacter-like organisms are frequently observed in the stomach of dogs but the relationship between these microorganisms and gastric pathology has not been clearly established. Different species of helicobacters are known to be present in the canine stomach but their specific prevalence in naturally infected dogs is unknown. The aims of this study were to isolate and characterize helicobacters in canine gastric biopsies, to compare the commonly used tests for the identification of Helicobacter spp. and to determine the occurrence of these species in dogs. Twenty-three out of 25 dogs (92%) were positive for Helicobacter-like organisms in cytological screening. Culture was successful from biopsies of 5/25 dogs. The isolates were analyzed by electron microscopy, biochemical and physiological tests, whole protein analysis and 16S rDNA sequencing. Helicobacter felis was identified in four samples and Helicobacter bizzozeronii in one sample. Only the whole protein analysis in combination with electron microscopy was able to clearly discriminate the two species. Compared to the high prevalence of Helicobacter-like organisms, the occurrence of H. felis and H. bizzozeronii, was low (17 and 4%, respectively). No Flexispira rappini-like organisms or H. salomonis were detected. Electron microscopy revealed that H. bizzozeronii-like microorganisms were present in three additional biopsies where we were unable to culture any Helicobacter-like organisms. These observations indicate that in the stomach of dogs not all helicobacters are culturable. The unculturable bacteria appeared to be the prevalent ones and may represent different spiral organisms. The presence of distinct helicobacters with different characteristics can reflect different roles in the pathogenesis of canine gastric disease.     

玉米大斑病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆和表达分析

利用RT-PCR技术克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的GAPDH基因StGAPDH。该基因c DNA全长1 014 bp,编码337个氨基酸;蛋白质分子量36 505.44,理论pI值6.72,属弱酸、亲水、稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽。亚细胞定位于细胞质、线粒体和细胞核的概率分别为43.5%、30.4%和21.7%;氨基酸序列高度保守,在亲缘关系上与玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和水稻胡麻斑病菌(Bipolaris oryzae)最近。荧光定量PCR分析表明,在病菌接种抗病玉米自交系3 d时,StGAPDH基因表达量显著高于接种5～10 d(P<0.05);接种感病玉米自交系时,接种10 d的StGAPDH基因表达量显著高于接种3～7 d(P<0.05)。     

芒果细菌性黑斑病菌XcmR基因的克隆与序列分析

根据黄单孢菌属LuxR基因的同源性设计简并引物XF/XR,采用同源克隆法从芒果细菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae)中获得了约1.4 kb的DNA片段。经测序和序列同源性分析表明,该基因片段长1 422 bp含有一个完整的LuxR同源基因,并命名为XcmR。生物信息学分析表明,XcmR基因完整ORF(开放阅读框)全长765 bp,编码254个氨基酸,分子质量和等电点分别约为28.2 ku和8.9,与GenBank中公布的Xanthomonas属LuxR或AhyR/AsaR氨基酸序列具有86%~99%相似性。系统聚类结果表明,XcmR与来源于柑桔溃疡病菌(X.axonopodis pv.citri)、番茄疮痂病菌(X.c.pv.vesicatoria)、水稻白叶枯菌(X.oryzae pv.oryzae)和甘蓝黑腐病菌(X.c.pv.campestris)的LuxR蛋白聚成一支。NCBI网站蛋白质保守结构域搜索表明,XcmR是LuxR蛋白家族的一员,具有LuxR蛋白相似结构。     

青稞类钙调素蛋白基因CML19的克隆、序列分析及原核表达

根据鉴定得到青稞类钙调素蛋白基因CML19的序列设计引物,以青稞叶片的cDNA为模板,扩增得到目的片段,对目的基因序列进行鉴定和分析,进一步构建该基因的原核表达载体pET28a-CML19,转入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。结果表明,扩增得到CML19的CDS序列全长为447bp,编码的蛋白质含有148个氨基酸,分子质量为16.46ku,理论等电点(pI)为4.40,总平均亲水性(GRAVY)为-0.176,不稳定系数为49.59,存在典型的EF手结构域;系统进化分析表明,青稞CML19与山羊草具有较近的亲缘关系;原核表达蛋白结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。初步阐明青稞CML19基因的序列特征,为进一步制备抗体、探讨CML19基因的功能奠定基础。     

普通小麦TaSEC14p-5基因的克隆及表达分析

磷脂酰肌醇转运蛋白Sec14是最先在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的磷脂酰肌醇转运蛋白,含有一个典型的SEC14保守结构域.S0ec14p磷脂酰肌醇转运蛋白广泛存在于真核生物细胞中,并参与膜运输途径、质膜发育、脂肪酸代谢、根毛的生长等生命活动,但未见此蛋白在作物逆境胁迫的有关报道.为研究Sec14p基因在小麦(Triticum aestivum)发育及逆境胁迫中的功能,本研究采用电子克隆方法从小麦京花9号中得到一个Sec14p基因,命名为TaSEC14p-5 (GenBank登录号:KU639968).氨基酸序列分析表明,该基因ORF全长为984 bp,编码327个氨基酸,相对分子质量为37.1 kD,理论等电点为7.70.在植物中该蛋白有典型的SEC14类基因家族保守域SEC14和一个CRAL_TRIO_N结构域.进化和聚类分析表明,小麦TaSEC14p-5基因与粗山羊草(Aegilops tauschii)磷脂酰肌醇转运蛋白AeSEC14p基因和水稻(Oryza sativa)磷脂酰肌醇转运蛋白Os02g0200000基因亲缘关系较近,蛋白相似度分别为96.45％和88.38％.采用qRT-PCR技术,对小麦孕穗期不同组织和不同非生物胁迫幼苗进行表达分析.发现该基因在根、茎、叶、颖壳、雄蕊和种子中均有表达,且在茎中表达量较高,雄蕊次之,根最低;该基因受高盐的强烈诱导,同时也受到脱落酸(abscisic acid,ABA) (200μmol/L)、干旱(PEG6000)和低温(4℃)不同程度的胁迫诱导.TaSEC14p-5在NaC1、ABA、PEG和4 ℃四种不同胁迫处理下,总体趋势为先上升后下降.结果推测,TaSEC14p-5基因可能参与了NaC1、ABA、PEG6000和4℃等不同程度的非生物胁迫处理,为进一步改良小麦抗逆性等分子机理研究提供了新的依据.     

扬州市耕地土壤重金属污染现状与演变趋势

[目的]研究2012年扬州市耕地土壤重金属污染现状及2002年以来的变化趋势。[方法]采集扬州市耕地土壤样品,分别测定总镉、总砷、总铬、总汞、总铅含量,加权统计计算平均值、标准差、变异系数等,并与2002年的数据进行对比分析。[结果]2012年扬州市不同重金属元素污染指数从高到低依次为总镉、总砷、总铬、总汞、总铅,不同重金属元素污染超标面积比例从高到低为总镉、总汞、总砷、总铅,总铬全部合格。与2002年相比,土壤中总镉、总铅含量均显著上升,总汞、总铬含量上升未达显著水平,总砷含量则显著下降;总镉、总汞、总砷、总铅超标面积比例均上升。[结论]重金属污染特别是总镉、总汞污染亟需引起高度重视。土壤总镉、总汞、总铅含量变异系数明显增大,说明总镉、总汞、总铅有明显的点源污染特点。     

紫色不结球白菜花色苷合酶基因BrcANS的克隆与表达分析

以不结球白菜紫色品系NJZX1-3和其绿色突变体NJZX1-0及其后代F₂的2个株系NJZX2-1和NJZX2-2为材料,研究花色苷合酶基因在紫色不结球白菜叶片花色苷合成途径中的作用。利用同源克隆的方法,分别在NJZX1-3及NJZX1-0中克隆到花色苷合酶基因;经序列比对发现,花色苷合酶基因的核苷酸和氨基酸序列在2种材料和大白菜中完全一致,长度为1077 bp,编码358个残基,第211~307肽段具有2OG-Fe (II)双加氧酶家族基因的结构域,被命名为BrcANS。BrcANS蛋白与同科芥菜的同源性高达99%,进化关系亦与其最相近。在全部4种材料鲜叶中,总花色苷的含量(TAC)与叶片紫色程度是一致的,其中,NJZX1-3叶片中总花色苷含量最高,达到80.15±5.74 mg 100 g^–1 FW;BrcANS表达量为NJZX1-0 < NJZX2-1 < NJZX2-2< NJZX1-3,与其总花色苷含量呈正相关。BrcANS的mRNA在NJZX1-3和NJZX1-0两种材料的不同组织中特异性表达：在叶片中高度表达,而在其他组织中表达较弱;另外,在两种材料间的表达亦存在显著差异,在NJZX1-3叶片中的表达丰度显著高于NJZX1-0。随着叶龄的增大,紫色不接球白菜叶片紫色变浅,BrcANS的表达量下降,但在NJZX1-3和NJZX1-0间的表达差异亦明显减小。以上结果表明,BrcANS基因是紫色不结球白菜中花色苷合成的关键基因之一,其mRNA表达量与叶片紫色直接相关,可能在其转录水平上调控叶片中紫色的形成。