非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

旨在通过预测分析和亚细胞定位研究非洲猪瘟病毒（ASFV） D1133L基因结构、亚细胞定位与功能间的关系。作者使用Mega6.0软件绘制了7株不同基因型的D1133L解旋酶和ASFV编码的其他5个解旋酶基因的系统进化树,使用EXPASY、PRABI和SWISS-MODEL软件预测了该基因所编码蛋白序列的二、三级结构;根据GenBank公布的ASFV序列（LR743116.1）,合成D1133L基因并构建其重组真核表达质粒pCMV-D1133L,蛋白免疫印迹（Western blot,WB）验证该基因表达后,将重组质粒转染至PK-15细胞,应用间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay,IFA）研究了该蛋白的亚细胞定位。结果表明,通过ASFV解旋酶的基因系统进化树,发现5种解旋酶基因均相对保守。D1133L基因全长3 402 bp,表达的蛋白为124.63 ku,G+C含量为6.1%,A+T含量为10.6%;二级结构分析表明α螺旋占48.90%,扩展链占13.50％,无规卷曲为33.27%;三级结构分析表明六自由度结构（six degree of freedom,QMQE）为0.20,覆盖率84%,且预测以α螺旋为主的高级结构;通过LOCSVMPSI分析预测,显示D1133L蛋白定位于细胞核内与细胞质内的概率是相同的。WB结果显示pCMV-D1133L质粒正常表达,IFA试验证明ASFV编码的解旋酶D1133L同时分布于细胞核和细胞质。本研究通过对D1133L基因序列、结构功能预测,并通过IFA验证了D1133L亚细胞分布,为进一步揭示D1133L基因功能奠定了一定基础。     

非洲猪瘟血清学诊断靶点的研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪高致死性传染病.ASFV编码蛋白p30、p54和p72等具有较高的免疫原性,且部分氨基酸序列较为保守,常被作为血清学诊断靶点,用于评价ASF不同阶段或发病程度的抗体水平变...     

非洲猪瘟病毒360-12L蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】获得抗原性好的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)12L蛋白用于ASFV血清学诊断技术研究。【方法】根据GenBank ASFV参考序列(登录号:NC₀44959.2)合成360-12L基因,并插入pET-28a(+)载体,构建原核表达质粒pET-28a-12L,将经测序鉴定正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导培养,筛选最佳诱导温度,同时分析其可溶性。随后通过亲和层析纯化蛋白,并对所获得的12L重组蛋白进行SDS-PAGE分析。将获得的12L重组蛋白作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,以获得鼠抗ASFV 12L蛋白的多克隆抗体,通过间接ELISA方法测定所制备的多克隆抗体效价,并用间接免疫荧光试验进行验证。【结果】成功构建了ASFV 12L蛋白原核表达质粒,重组菌pET-28a-12L-BL21在37℃6 h时表达量较高,主要以包涵体形式表达,可在54.7 ku处出现明显条带。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗ASFV 12L蛋白多克隆抗体效价>1∶512 000,间接免疫荧光试验结果表明,所制备的...     

非洲猪瘟病毒VP73结构蛋白表达及鉴定

根据GenBank登录的非洲猪瘟病毒(ASFV) VP73基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因片段,克隆至pUC57载体中.设计1对引物,PCR扩增获得429 bp的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX-KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化至表达菌株BL21 (DM3)中,进行体外诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性.结果显示,成功构建表达重组载体pGEX-KG-VP73,对该重组载体进行诱导,有效表达了41 ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的17％,Western blot分析证实该蛋白具有良好反应原性.     

检测非洲猪瘟McAb-ELISA竞争试剂盒的建立及初步应用

用基因重组技术制备的非洲猪瘟蛋白P54免疫BALB/C小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用有限稀释法进行克隆,获得能稳定分泌抗ASFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。使用该单克隆抗体,建立了检测血清中非洲猪瘟抗体的竞争法ELISA。实验结果表明：ELISA竞争法特异性高,无交叉反应,灵敏度高于间接免疫荧光法,可用于猪血清的非洲猪瘟抗体检测。该法的建立对非洲猪瘟实验诊断的标准以及流行病学调查具有重要的现实意义。     

CRISPR/Cas9技术在猪常见病毒性疾病防控中的应用

CRISPR/Cas系统是一种存在于古生菌和细菌中重要的适应性免疫系统,CRISPR/Cas9技术可以实现对特定基因序列进行编辑,目前已经成为应用最广泛的基因编辑工具,利用其可以实现对病毒进行基因改造或解析宿主与病毒相互作用,优化疫苗生产和抗病毒动物分子育种等.猪作为我国最重要的食品动物,在国民经济和社会稳定中发挥着重...     

非洲辣椒种质资源鉴定与评价

对非洲引进的42份辣椒材料进行苗期和田间黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病和疮痂病的抗性鉴定,筛选出14份抗病性较好的种质资源。通过对其农艺性状综合评价,42份辣椒资源在生长势、坐果性、果形、果色等主要性状存在明显差异,筛选出3份抗病毒病、疮痂病及商品性好的辣椒优异种质资源。     

Development of a ladder-shape melting temperature isothermal amplification (LMTIA) assay for detection of African swine fever virus (ASFV)

BackgroundDue to the unavailability of an effective vaccine or antiviral drug against the African swine fever virus (ASFV), rapid diagnosis methods are needed to prevent highly contagious African swine fever.ObjectivesThe objective of this study was to establish the ladder-shape melting temperature isothermal amplification (LMTIA) assay for the detection of ASFV.MethodsLMTIA primers were designed with the p72 gene of ASFV as the target, and plasmid pUC57 was used to clone the gene. The LMTIA reaction system was optimized with the plasmid as the positive control, and the performance of the LMTIA assay was compared with that of the commercial real-time polymerase chain reaction (PCR) kit in terms of sensitivity and detection rate using 200 serum samples.ResultsOur results showed that the LMTIA assay could detect the 10⁴ dilution of DNA extracted from the positive reference serum sample, which was the same as that of the commercial real-time PCR kit. The coincidence rate between the two assays was 100%.ConclusionsThe LMTIA assay had high sensitivity, good detection, and simple operation. Thus, it is suitable for facilitating preliminary and cost-effective surveillance for the prevention and control of ASFV.     

重组木制造技术研究进展与展望

依据原料基本单元形态的不同(细长小径材形态和宽薄单板),将重组木分为两类:传统重组木和高性能重组木。围绕两类重组木的制备工艺,重点论述主要工艺的研究进展,分析瓶颈问题;针对高性能重组木关键技术的薄弱环节,提出优化木束单元精细疏解技术、提升加工装备自动化水平、开发绿色功能化的高端产品,构建完善的理论技术体系等建议。     

非洲猪瘟病毒免疫逃逸分子机制研究进展

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，至今没有研发出安全有效的疫苗，一旦暴发会造成重大经济损失。ASFV在和宿主长期作用过程中，通过抑制干扰素和炎症反应，调节凋亡、自噬及细胞免疫等多种途径逃逸机体免疫反应促进自身复制，但具体的机制仍不完全清楚。ASFV复杂的免疫逃逸机制可能是阻碍有效疫苗研发的关键因素之一。借助生物信息学技术对ASFV的基因组和蛋白质组深入分析，筛选病毒的免疫调控关键基因和保护性抗原表位，将在ASFV免疫逃逸分子机制的研究与疫苗研发中发挥重要作用。本文主要对ASFV感染引起的免疫应答反应及可能的免疫逃逸机制研究进行概述，以期为ASF疫苗研制及综合防控提供思路。