非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的优化表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了实现非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)p54基因在大肠杆菌中的高效表达,同时建立以ASFV-p54重组蛋白为抗原的间接ELISA抗体检测方法,本试验根据Gen Bank(序列号：NC＿044943.1)公布的ASFV p54的基因序列,设计一对特异性引物,扩增构建p GEX-6P-1-p54原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行复制,经IPTG诱导表达,对重组蛋白利用SDS-PAGE分析和免疫印迹鉴定正确后,进行表达条件优化,并纯化重组蛋白。随后用ASFV-p54重组蛋白为包被抗原,通过条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种稳定的血清ASFV抗体检测方法。结果显示,ASFV p54基因成功克隆到p GEX-6P-1原核表达载体中,得到p GEX-6P-1-p54原核表达质粒;转化E. coli菌株BL21(DE3)中,经诱导表达得到重组蛋白,大小为46k Da;成功建立测定ASFV抗体的间接ELISA方法,优化后确定最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀...     

铜绿假单胞菌oprD基因的克隆、表达与纯化

试验研究铜绿假单胞菌外膜蛋白编码基因oprD在大肠杆菌中的克隆及异源表达与纯化。试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌oprD基因序列,设计合成了一对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了该目的基因,随后将其克隆于原核表达载体pET32a中,转化入大肠杆菌BL21 (DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并优化了表达条件,同时对表达的蛋白进行纯化。结果显示,试验成功构建了重组载体pET32a-oprD,oprD与组氨酸(His)标签形成的融合蛋白约为65 kD。最佳表达条件为菌液培养5 h时加入0.7 mmol/L的IPTG,37℃下诱导4.5 h,纯化的蛋白经SDS-PAGE分析获得了较高纯度的OPRD重组蛋白。研究结果可以为铜绿假单胞菌OPRD蛋白功能研究及其相关诊断试剂和疫苗的研制提供参考。     

2019年福建某原种猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因的遗传变异分析

为确诊福建某原种猪场保育猪群临床暴发的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),以及了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株流行情况,从该猪场采集2周龄?8周龄各周龄段保育猪临床疑似发病猪全血各5份,将各周龄段5份血样各取50 μL混匀,并分别命名为2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W.利用PRRSV ORF5基因特...     

口蹄疫病毒VP1基因密码子偏好性分析

VP1蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)的主要结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体以及激发保护性免疫应答。为探究VP1基因密码子偏好性,筛选出其最佳体外表达系统,使用Visual Gene Developer、CodonW、GraphPad Prism等软件,对VP1基因进行密码子偏好性分析,同时将VP1基因密码子使用频率与大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统作了比较。结果显示,VP1基因的CAI为0.21,ENC为55.43,GC3S为65.26%,表明该基因密码子使用偏好较弱并且密码子偏好以G/C碱基结尾。结合VP1基因与各表达系统密码子使用频率比值,发现其与昆虫杆状病毒表达系统频率比值差异最小且CAI最大,因此推断昆虫杆状病毒表达系统是FMDV VP1基因最适体外表达系统。本研究为FMDV亚单位疫苗研制等提供了技术基础。     

禽腺病毒血清4型贵州株全基因序列分析

为了解禽腺病毒血清4型(FAdV-4)地方流行毒株的分子进化情况,基于实验室分离的2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株,分别对2株FAdV-4毒株进行PCR分段扩增,扩增产物克隆至载体,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后筛选出重组质粒进行测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,获得FAdV-4贵州株的全基因序列,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,通过PCR分段扩增成功获得了2株FAdV-4贵州株(GZ-BJ株和GZ-QL株)的全基因序列,长度分别为43352、43723 bp,FAdV-4 GZ-BJ株全基因序列长度比FAdV-4 GZ-QL株短371 bp,少6个ORF(22K、putative 9.1 ku、u-exon、ORF17、ORF28、ORF42),二者的氨基酸同源性为57.1%。2株FAdV-4贵州株同国内外不同地区FAdV-4毒株核苷酸同源性在88.7%~100%,与FAdV-4经典毒株ON1比对,2株FAdV-4贵州株和国内FAdV-4分离株均缺失ORF19、ORF27、ORF30。系统进化树分析显示,2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株仍属于Ⅰ群C种FAdV。研究结果表明,2株贵州株FAdV-4 GZ-BJ株和FAdV-4 GZ-QL株较国内外FAdV-4毒株均存在进化与突变,且FAdV-4 GZ-BJ株变化较大,但尚未改变其血清型,这为探索FAdV-4致病机理的分子机制研究提供依据。     

山羊源产单核细胞李斯特菌的分离与鉴定

从贵州省盘县某养羊场病例组织样本中分离出1株疑似产单核细胞李斯特菌(Lm)。通过革兰染色、生化鉴定、PCR扩增hly基因、克隆、测序、序列分析及药敏试验等方法对可疑菌株进行分析鉴定。结果显示,该分离菌的培养特性、菌落形态、菌体形状特征、生理生化特征均与文献报道的产单核细胞李斯特菌相同,并从该分离菌株基因组中扩增到大小约850bp的Lm的特异性DNA片段,其序列与GenBank中其他Lm地方株核苷酸同源性在39.1%~99.7%之间,其中与从发病动物分离到的加拿大、瑞士参考株同源性最高,均达到99.7%,与其他途径分离到的参考菌株同源性都很低,分子水平上进一步证实分离菌株为产单核细胞李斯特菌,且从不同途径分离的地方株hly基因差异大。研究结果为本病临床防控与治疗提供理论依据。     

α-银环蛇毒素融合基因表达载体的构建及原核表达

设计并人工合成2条引物,对作者构建的重组质粒pMD-α-BGT进行PCR扩增获得α-BGT基因。将目的基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT。克隆质粒经BamHⅠ、NotⅠ双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,成功构建融合基因表达载体pGEX-α-BGT,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。表达产物经15%SDS-PAGE分析,在约34ku处可见明显的外源蛋白质表达带,与预计的分子量大小一致,其表达量约占细菌总蛋白的32.6%。Westernblotting和间接ELISA检测结果表明,α-BGT的融合表达蛋白与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。     

北极狐白介素-18基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的犬白介素-18（IL-18）基因序列,设计了1对特异性引物。将北极狐外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导,用TRIzol裂解,提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增狐狸IL-18基因,连接pMD18-T载体,转化DH5d感受态细胞,获得阳性重组质粒。核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长590bp,含582bp的开放阅读框,编码193个氨基酸,与已知犬IL-18序列的同源性高达98．7％,氨基酸同源性为96．4％。     

伪狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表达

本研究以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,PCR扩增含ULl8全长基因的片段并克隆至pMDl8-T载体,采用双脱氧末端终止法测序.序列分析显示ULl8全长891 bp,可编码297个氨基酸.将该基因亚克隆到原核表达栽体pQE.82L的6×His标签下游,获得原核表达质粒pQE-UL18,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白6 × His-UL18的分子量约为33 ku.Western blot证实,表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.进一步将UL18基因插入真核表达栽体pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-UL18,转染HeLa细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现,转染后24 h融合蛋白EGFP-UL18主要定位于细胞浆,仅有部分定位于细胞核,而48 h时则主要定位在细胞核.但对照载体pEGFP.N1转染细胞的荧光一直呈弥散型分布于整个细胞中.     

牦牛、犏牛睾丸组织中SYCP 3基因mRNA表达水平研究

本文采用RT-PCR和荧光定量PCR对牦牛SYCP3基因的组织表达,以及SYCP3基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达水平进行分析。结果表明,SYCP3基因在牦牛睾丸组织中特异表达,牦牛与犏牛睾丸组织中SYCP3基因的表达水平差异极显著（P〈0．01）。睾丸和附睾组织切片显示,牦牛睾丸组织中可见各级生精细胞,附睾内可见发育良好的精子,而犏牛睾丸组织中无次级精母细胞和更高级生精细胞、附睾内未观测到精子,与人和小鼠SY-CP3基因缺失或表达水平降低出现的表型一致,可以认为SYCP3基因的表达水平可能与犏牛的雄性不育有一定的关系。