青枯菌M5菌株特异基因组消减文库的构建

为筛选青枯菌M5菌株特有的序列,利用SSH技术对青枯菌生理小种5号菌株M5（tester）和生理小种1号菌株GMI1000（driver）基因组进行了比较。分别提取二者基因组DNA,RsaⅠ酶切,将酶切后M5菌株DNA分为两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR扩增,并检测连接效率与消减效率。将获得的消减PCR产物,即差异基因/差异DNA片段,与pGEM-T载体连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,建立消减文库。随机挑取96个白色克隆,经菌液PCR法测定,80个为预期阳性,含有预期的插入片段。首次构建了青枯菌M5菌株特异基因的抑制消减文库,为进一步筛选、克隆青枯菌M5菌株特异核苷酸片段奠定了基础。     

早熟砂梨‘苏翠1号’与其亲本‘翠冠’‘华酥’成熟果实差异代谢产物及差异基因比较分析

‘苏翠1号’梨因其极早熟、汁多味甜、肉质细脆而深受广大消费者喜欢。为了解‘苏翠1号’成熟果实主要代谢产物及代谢通路相关基因表达情况,探究其果实优异性状形成的物质和分子基础,对‘苏翠1号’及其亲本‘翠冠’和‘华酥’成熟果实样本进行代谢组和转录组测序分析。代谢组分析发现,3个品种间,前25个差异代谢产物主要包括有机酸、碳水化合物、氨基酸、甘油磷酸脂、脂肪酸和绿原酸。HPLC测定表明,蔗糖含量在‘苏翠1号’中最高,葡萄糖含量在‘翠冠’中最高,果糖含量在‘苏翠1号’和‘翠冠’中相似,略高于‘华酥’,山梨醇含量在‘苏翠1号’和‘华酥’中均显著低于‘翠冠’;苹果酸含量在‘苏翠1号’中最高,柠檬酸含量在‘华酥’中最高,‘苏翠1号’和‘华酥’总酸含量相近,均高于‘翠冠’。氨基酸含量分析表明,‘苏翠1号’的氨基酸总含量及天冬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸含量显著高于‘翠冠’和‘华酥’。转录组GO和KEGG分析表明,相较于‘翠冠’和‘华酥’,‘苏翠1号’有机底物分解过程、脂质代谢、有机酸生物合成、羧酸生物合成、多糖代谢等生物学过程及代谢途径显著富集。进一步挖掘差异基因发现,糖代谢中的SPS、山梨醇代谢中的S6P...     

感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库的构建

【目的】用强、弱PRRSV GD株传代毒株感染Marc-145细胞,构建Marc-145细胞的差异基因cDNA文库。【方法】以感染PRRSV GD株第100代弱毒株的Marc-145 cDNA为测试组(Tester),以感染PRRSV GD株第5代强毒株的Marc-145 cDNA为对照组(Driver),采用抑制性消减杂交方法,构建强、弱PRRSV GD株感染的Marc-145细胞差异基因cDNA文库,并使用LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)技术对试验结果进行验证。【结果】经4次抑制性消减杂交重复试验,得到S8、S29、L6、L26及L30等5个稳定差异表达的基因。LAMP结果显示,S8、S29、L6、L26及L30均为差异表达基因,这与抑制性消减杂交结果吻合。【结论】成功构建了感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库,为研究S8、S29、L6、L26和L30基因与PRRSV感染体外培养细胞Marc-145的关系奠定了基础。     

mRNA差异显示法筛选‘砀山酥梨’褐皮芽变相关差异表达基因

【目的】研究‘砀山酥梨’褐皮芽变形成机理。【方法】以‘砀山酥梨’及其褐皮芽变‘锈酥’花后110 d幼果果皮为试材,利用mRNA差异显示技术筛选相关差异表达基因,基于Gene Ontology方法、采用Blast2 Go软件进行基因功能分析,结合real-time RT-PCR技术验证差异表达基因在花后不同时期的表达水平差异。【结果】筛选出的63条目的片段中,60条质量较高、3条质量较低;差异表达基因包含α-微管蛋白、甲基转移酶、甘露糖- 6-磷酸异构酶、液泡膜焦磷酸酶和泛素等数十个基因。花后90—150 d,α-微管蛋白基因在‘锈酥’中表达量均高于‘砀山酥梨’,特别是在花后90和110 d,其表达量分别为‘砀山酥梨’的5倍和3倍。而在花后90和110 d时,Ca2+/CaM基因在‘锈酥’果皮中的表达略高于‘砀山酥梨’;在120—150 d时,Ca2+/CaM依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因在‘锈酥’果皮中的表达明显低于‘砀山酥梨’。除花后130 d,甘露糖- 6-磷酸异构酶基因在‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中表达差异不明显。【结论】由试验结果推测,α-微管蛋白基因在果实发育全程的增量表达,以及蛋白激酶基因在果实发育后期表达水平下调,使‘锈酥’果皮细胞壁加厚、木栓化程度加大,导致了‘锈酥’褐色果皮的形成。     

盐胁迫下转 DcCIPK24 拟南芥的转录组比较分析

【 目 的】 探 究 铁 皮 石 斛（Dendrobium catenatum Lindl.）DcCIPK24 的 下 游 响 应 基 因, 为 研 究DcCIPK24 提高耐盐性的分子调控途径提供指导。【方法】利用 Illumina NovaSeq 6000 测序平台对 200 mmol/L NaCl 处理和对照组的转 DcCIPK24 拟南芥、野生型拟南芥进行测序,分析差异表达基因的富集通路,并对通路中的差异基因进行荧光定量 PCR 验证。【结果】盐胁迫下,从 2 个转基因拟南芥株系与野生型拟南芥的比较组合中共鉴定出 96 个差异表达基因;GO 注释分析发现 96 个差异基因主要被富集在分子功能相关通路;KEGG 富集分析发现差异基因主要被注释在氨基糖和核苷酸糖代谢、植物 MAPK 信号通路和甘油酯代谢通路中,选取上调表达的差异基因 AtGPAT5、AtSIRK、AtMEE25、AtUGE5 和下调表达基因 AtAMT1-2、AtATTI3、AtCYP71A25、AtLHCB4.3 进行实时荧光定量 PCR 验证,结果表明盐胁迫下 8 个差异基因表达趋势与转录组数据基本一致。【结论】盐胁迫下,DcCIPK24 主要通过氨基糖和核苷酸糖代谢途径、植物 MAPK 信号途径和甘油酯代谢通路响应耐盐。     

感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库的构建

【目的】用强、弱PRRSV GD株传代毒株感染Marc-145细胞，构建Marc-145细胞的差异基因cDNA文库。【方法】以感染PRRSV GD株第100代弱毒株的Marc-145 cDNA为测试组（Tester），以感染PRRSV GD株第5代强毒株的Marc-145 cDNA为对照组(Driver)，采用抑制性消减杂交方法，构建强、弱PRRSV GD株感染的Marc-145细胞差异基因cDNA文库，并使用LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）技术对试验结果进行验证。【结果】经4次抑制性消减杂交重复试验，得到S8、S29、L6、L26及L30等5个稳定差异表达的基因。LAMP结果显示，S8、S29、L6、L26及L30均为差异表达基因，这与抑制性消减杂交结果吻合。【结论】成功构建了感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库，为研究S8、S29、L6、L26和L30基因与PRRSV感染体外培养细胞Marc-145的关系奠定了基础。     

铁皮石斛叶色突变体初步研究

为了探究铁皮石斛叶色突变机理,以铁皮石斛叶色突变体(doyo1)和正常植株(TP35)为试验材料,对其表型、叶绿素含量进行测定,并进行无参转录组测序分析。结果表明,doyo1与TP35相比,株高、茎粗均较低,生长速度较慢;叶绿素含量下降,仅为TP35的15%左右,叶绿素a/b比值(Chl a/b)显著升高。利用转录组测序技术分别从doyo1和TP35叶片中获得4.58Gb和4.90Gb有效数据(clean data),de novo组装后得到60 363条通用基因(Unigenes),其中长度大于1kb的有12 390条,N50为1 295bp。对Unigenes进行表达分析,共获得1 560条差异表达基因(DEGs)。对得到的DEGs进行生物学功能注释,获得总注释信息为1 325条。通过对注释信息进行GO和KEGG富集分析,结合定量PCR验证,结果表明,铁皮石斛叶色突变体形成的原因可能是do GLK1低水平表达和do Ftsz不表达导致叶绿体合成和分裂受阻,叶片细胞内叶绿体数量大大降低,进而叶绿素(Chl)和类胡萝卜素(Car)含量整体下降。本试验结果为研究铁皮石斛叶色突变体形成的机理提供了依据,同时,为观叶型铁皮石斛定向育种提供了参考。     

玉足海参变态附着阶段转录组分析

海参幼苗发育需要经历耳状幼体、樽形幼体、五触手幼体及幼苗阶段,而从浮游幼体变态发育至附着幼苗阶段的高死亡率是热带海参繁育中的共性问题,目前有关热带海参变态发育的调控机制仍不清楚。以玉足海参(Holothuria leucospilota)为研究对象,采集小耳幼体(A)、中耳幼体(B)、大耳幼体(C)和樽形幼体(D) 4个时期样品进行高通量转录组测序分析,以探究其变态发育的分子机制。结果显示,共产生83.6 GB Raw reads,拼接获得93 528个Unigenes。对4个组测序文库的相邻组间(A＿vs＿B, B＿vs＿C, C＿vs＿D)进行两两比较,A＿vs＿B、B＿vs＿C和C＿vs＿D的差异表达基因数目分别为17 732、11 757和11 319个。GO功能富集显示,差异基因主要富集于分子功能、催化活性等与细胞成长相关的GO功能。此外对KEGG通路进行了分析,结果显示差异基因显著富集于PI3K-Akt、细胞周期、癌症途径等与细胞分化增殖、凋亡相关的信号通路中,其中在幼体由浮游的大耳状幼体变态至附着的樽形幼体过程中,癌症途径的富集频率显著上升,表明其在幼体生长发育模式转换上...     

转录组测序技术在鹅产业相关研究中的应用

鹅是一种重要的经济动物,其肉中蛋白质含量很高,脂肪含量很低,被贵州省列为重点发展的绿色健康食品之一。随着转录组测序技术的发展,应用转录组学解析鹅的繁殖性能、肉质与生长性状、宿主与病原的关系、皮肤毛囊等的分子调控机制,成为近年来研究的热点。通过研究鹅遗传资源,解析其分子调控机制,进而对鹅进行育种工作,推动鹅产业发展。笔者对近年来鹅相关的研究进行综述,旨在为后续研究提供参考资料。     

镉胁迫下中辽1号杨转录组分析

【目的】分析镉胁迫下中辽1号杨的转录水平,筛选差异表达基因,挖掘与镉胁迫相关的功能基因,为深入探索中辽1号杨对镉胁迫响应的分子机制提供理论依据。【方法】以中辽1号杨为试验材料,采用盆栽试验的方法将其扦插于土壤Cd含量为20 mg/kg（M20）的花盆中,以不加Cd为对照（CK）,80 d后采集不同处理中辽1号杨叶片进行转录组测序,使用DESeq2软件筛选CK与M20处理中辽1号杨的差异表达基因,将得到的差异基因在基因本体数据库（gene ontology,GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）、蛋白相邻类聚簇数据库(clusters of orthologous groups of proteins,COG)中进行注释,分析差异表达基因在不同数据库中的注释信息。随机挑选6个差异表达基因（超氧化物歧化酶（SOD）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STK）、脱落酸（ABA）、T复合蛋白1（TCP1）、MYB基因（MYB）、丝裂原活蛋白激酶12（MAPK12））,利用Primer 5软件设计特异性引物进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试验,检测这6个基因表达水平的变化,验证转录组结果的准确性。【结果】在CK和M20处理的中辽1号杨中,共发现3 812 个差异表达基因,其中上调表达的有2 209 个,下调表达的有1 603 个。GO 分析发现,差异表达基因注释到3大类49个功能组中,其中与代谢过程有关基因最多。转录组KEGG代谢通路分析发现,差异表达基因主要在信号转导途径、代谢途径和生物合成途径富集。COG分析发现,1 455个差异基因被注释到22种分类中,其中一般功能预测基因注释最多,其次是信号转导机制基因。结合各数据库分析结果发现,Cd胁迫下中辽1号杨转录组的注释结果中代谢过程和信号转导过程相关基因较多。镉胁迫下差异表达基因最多的家族是ABC、MYB、WRKY、bHLH和NAC基因家族,挖掘出与镉胁迫相关基因WRKY家族基因47（WRKY47）、硝酸盐转运蛋白基因（NRT）、ABC家族转运蛋白基因2（ABC2）、苹果酸脱氢酶（MDH）、谷胱甘肽S-转移酶基因（GSTs）、NAC家族基因2（NAC2）的表达量显著上调,MYB家族基因44（MYB44）、重金属相关异戊二烯化植物蛋白基因39（HIPP39）的表达量显著下调。RT-qPCR结果显示,随机挑选6个差异表达基因表达量的变化趋势与转录组测序结果一致。【结论】镉胁迫后中辽1号杨转录组的差异表达基因主要富集在代谢过程和信号转导过程,挖掘出与镉胁迫相关基因,分别是WRKY47、NRT、ABC2、MDH、GSTs、NAC2、MYB44、HIPP39,为深入探索杨树对镉胁迫响应的分子机制提供了理论依据。