马铃薯致病疫霉EST—SSRPCR反应体系的优化

由致病疫霉（Phytophthora infestans Montagne de BaT）引起的马铃薯晚疫病是危害马铃薯生产的最严重病害。试验以致病疫霉菌株HH06—23为模板,以Pi08N为引物,研究致病疫霉EST—SSR PCR反应体系中各主要成分和退火温度对扩增结果的影响。优化后的PCR反应体系为：25ng模板DNA,0．5mmol·L^-1。dNTPs,2μL 10×Buffer（Mg^2＋ Free）,1．75mmoL·L^-1 MgCl2,15pmol引物,1．2U Tap DNA聚合酶,加ddH2O至20μL;同时确定引物退火温度为63℃。PCR体系稳定性试验结果表明,优化后的致病疫霉EST—SSR PCR反应体系稳定、可靠．适合进行致病疫霉群体遗传多样性研究。     

我国部分省(区)猪圆环病毒3型的分子流行病学研究

2016年美国报道了一种可引起猪皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍、呼吸道及高热等多系统炎症的新型病毒猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)。为了解我国PCV-3的感染情况,针对PCV-3保守区设计一对特异性引物,对10个省106份样品进行PCR检测并测序分析。结果表明,10个省(区)中6个省(区)为阳性,地区阳性率60%;66个猪场中感染PCV-3的猪场为12个,猪场阳性率为18.2%;106个样品中检测PCV-3阳性的样品为19例,样品阳性率为18.0%。研究结果为更多了解PCV-3在我国感染情况提供了数据基础。     

基于实时荧光定量PCR技术检测桑丁香假单胞菌

由桑丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.mori,以下简称Psm)引起的桑疫病是一种毁灭性的桑树细菌性病害,建立对病原菌的早期检测技术,有利于及时制定病害的防控技术措施。依据致病性相关基因hrp Z的片段设计的一对引物能够在Psm中特异性地扩增出195 bp大小的条带,而用于对其他致病变种的丁香假单胞菌和其他种属病原菌的扩增则没有此条带。利用Psm14-7菌株基因组DNA为模板进行实时荧光定量PCR(q PCR)扩增,模板DNA质量浓度在6×10~(-5)~6 ng/μL范围内与扩增所得Ct值呈现良好的线性关系,线性方程为y=-3.224 69x+14.034 45(R~2=0.997 09),检测的最低限为(60±0.001 2)fg/μL;以Psm14-7菌液为模板进行q PCR,菌液浓度在1×10~2~1×10~8CFU/m L范围内与Ct值呈现良好的线性关系,线性方程为y=-4.562 15x+46.911 67(R~2=0.988 72),最低检测限为(10~2±0.008 3)CFU/m L。于桑树植株人工接种Psm后不同时间,对出现各种症状植株中的菌群数量进行q PCR检测,结果显示:接种后的第4~8天可能为病原菌诱导桑树的过敏性反应和系统获得性抗性关键时期,影响到了Psm的增殖速度;能引起健康桑树暴发桑疫病的致病菌最低浓度为(1.5×10~8±0.076 8)CFU/g。建立的q PCR检测方法,对由Psm引起的桑疫病的田间早期诊断和及时防控具有一定指导意义。     

我国一杂交商品猪IgM恒定区CH3-CH4亚区的克隆与表达

目前，国内对猪免疫球蛋白方面的研究较少，赵凯等于1999年对猪IgGH链进行了克隆和表达一。BOSCH等克隆了猪的IgM链，但至今未有关于猪IgM功能区蛋白表达方面的研究报道。本文将对我国一商品杂交品种皮杜猪的IgMCH3-CH4区进行了PCR扩增、克隆、序列测定和分析，并通过表达载体进行表达。其目的是为以后进一步研究IgM抗体亚区的功能打下基础。     

鸡细小病毒二温式PCR检测方法的建立

根据鸡细小病毒(chicken parvovirus,ChPV)的保守基因NS1设计了1对特异性引物,建立并优化了能够快速检测ChPV的二温式PCR方法。结果表明:该二温式PCR只对ChPV敏感,扩增产物为302 bp的特异性条带,其最低能检测到38.6 fg的ChPV DNA;而对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒不敏感。对60份临床样品进行检测,检出率为20%(12/60)。说明所建立的ChPV二温式PCR方法是一种快速简便、特异性强、敏感性高的检测方法,适用于ChPV的临床检测。     

酿酒酵母菌诱导SBD-1 mRNA表达的研究

为了探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(Sheep Beta-Defensin-1,SBD-1)表达的调节作用。建立绵羊瘤胃上皮细胞培养体系作为体外试验模型,用不同浓度酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞刺激2 h后分别进行不同时间的诱导培养,然后利用实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)研究接受刺激后瘤胃上皮细胞中SBD-1 mRNA表达的差异。结果表明,在各时间组内,SBD-1 mRNA的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势,当菌液浓度为5.2×107CFU/m L时表达量均达到最大,并与对照组和其他浓度组相比差异极显著(P﹤0.01)。当菌液浓度一定时,SBD-1 mRNA的表达量先是随着诱导培养时间的延长而呈上升趋势,诱导培养时间为12 h时SBD-1 mRNA表达量达到峰值,之后呈下降趋势。因此,当浓度为5.2×107CFU/m L的菌液诱导瘤胃上皮细胞12 h时,SBD-1基因的表达量达到最高,且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著(P﹤0.01)。本试验结果表明,酿酒酵母菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且浓度为5.2×107CFU/m L的菌液诱导瘤胃上皮细胞12 h时,SBD-1的表达量达到最高。     

牛冠状病毒和轮状病毒的双重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速诊断牛病毒性腹泻疾病的方法,利用本研究室分离鉴定的牛冠状病毒(BCV)和牛轮状病毒(BRV)毒株,根据GenBank中登录的BCV、BRV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增BCV、BRV的引物,经过条件优化,建立了检测BCV、BRV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为244 bp和382 bp.该方法检测BCV和BRV的敏感度分别为1个和100个TCID50/100μL.应用这一方法能从病料中检测出这2种病毒.结果表明该双重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于这2种病毒性疾病的快速诊断.     

伊氏锥虫HGPRT基因cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

根据引物设计的一般原则，参照伊氏锥虫HGPRT基因的核苷酸序列设计、合成一对引物，PCR扩增伊氏锥虫HGPRT基因cDNA。低熔点琼脂糖回收：PCR产物，并将其克隆至pGEM—T Easy载体中，经酶切、PCR鉴定和序列分析，获得重组中间质粒pGEM／HGPRT。重组中间质粒pGEM／HGPRT经Nco I和Sal I双酶切，回收目的片段HGPRT，以非融合形式插入原核表达质粒pBV220构建表达质粒pBV／HGPRT，转化大肠杆菌DH5a，42℃诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析，表达产物HGPRT的分子量约为23kD，与理论推算值相符，表达率占总菌体蛋白的19％，经间接ELISA检测，表达产物能被伊氏锥虫阳性血清所识别。     

半胱胺和大豆黄酮对东北细毛羊部分组织IGF-I mRNA表达量的影响

为了探讨半胱胺和大豆黄酮对东北细毛羊肝脏、肌肉和皮肤组织中IGF-I mRNA表达量的影响,选取体重27～28 kg,5～6月龄健康的东北细毛羊育成羊21只,随机分成7组,每组3个重复,每个重复1只,采用实时荧光定量PCR法检测肝脏、肌肉和皮肤组织中IGF-I mRNA相对表达量.结果表明:(1)半胱胺和大豆黄酮均能显著提高东北细毛羊的生长性能(P<0.05),其中以7.5 mg/kg BW半胱胺组和7.5 mg/kg BW半胱胺+3 mg/kg BW大豆黄酮组效果较佳;(2)半胱胺和大豆黄酮对东北细毛羊肝脏和肌肉中IGF-I mRNA表达量有显著的提高作用(P<0.05),但各试验组之间差异不显著(P>0.05);(3)对皮肤中表达量的影响:对照组与添加3和6 mg/kg BW大豆黄酮组和7.5 mg/kg BW半胱胺+3 mg/kg BW大豆黄酮组之间差异显著(P<0.05),与添加7.5和15 mg/kg BW半胱胺组和15 mg/kg BW半胱胺+6 mg/kg BW大豆黄酬组之间差异不显著(P>0.05).由结果可知,半胱胺和大豆黄酮均能提高肝脏和肌肉中IGF-I mRNA的表达量,但协同应用并没有促使IGF-I mRNA表达量在肝脏、肌肉和皮肤组织中的明显提高,综合分析以添加3 mg/kg BW大豆黄唰效果最佳.     

转基因牛多重PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测转基因牛的多重PCR方法,针对牛线粒体16 S rRNA基因(BOS mtD-NA16 S rRNA,BOS)、转基因动物常用标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ)、人乳铁蛋白编码基因(human laetoferrin gene,hLF)、人-α-乳清蛋白编码基因(human α-lactalb...