莲腐败病菌遗传转化体系的构建

由共享镰刀菌Fusarium commune引起的莲腐败病是我国莲生产上的主要病害之一。本研究以强致病力菌株FCN23为供试菌株,通过PEG介导的遗传转化法研究了菌龄、酶解时间和渗透压稳定剂等对原生质体制备的影响。结果表明,分生孢子在YPD液体培养基培养24 h获得新鲜菌丝,在酶解时间为2.5 h,渗透压稳定剂为0.7 mol/L NaCl溶液时原生质体制备效率最高。进而将遗传霉素的抗性基因和绿色荧光蛋白基因转入莲腐败病菌原生质体中,获得了稳定表达的转化子,能够稳定遗传gfp基因,说明莲腐败病菌的遗传转化体系构建成功。该体系的建立为莲腐败病菌的侵染过程及基因功能研究奠定了基础。     

血耳原生质体制备及其再生条件研究

采用L16(45)正交设计方法探讨了酶解体系、酶解温度、酶解时间、菌龄、渗稳剂对血耳原生质体制备及其再生的影响。结果表明:静置培养5 d菌丝体以0.6 mol/L蔗糖为渗稳剂,采用1%溶壁酶+1%蜗牛酶,32℃酶解3 h,制备率为2.950×107个/mL,其再生率可达4.508×10~(-3)。     

异质性体细胞杂种育性及其生物学性状研究

普通烟草（Nicotiana tabacum）和粉蓝烟草（N.glauca）的叶肉原生质体经高Ca++,高pH的PEG溶液诱导融合,并再生出体细胞杂种植株。杂种植株中发现形态偏普通烟草,雌蕊发育正常,雄蕊发育异常,且融合双亲部分细胞质和细胞核的杂种株,将此株与普通烟草栽培品种（Speight G-28♂）回交,回交1代（BC#-1）、回交2代（BC#-2）保持高度不育,回交3代（BC#-3）、4代（BC#-4）育性有一定的恢复,并出现育性分离。让恢复一定育性的株系自交,获得有一定育性的稳定株系,继续与其它普通烟草栽培品种回交（Speight G-80♂,Speight G-140♂,Jingyehang♂等）,恢复其不育特性,并稳定地遗传。用普通烟草栽培品种（Jingyehuang♂等）反交时,后代育性恢复正常。并相应对各世代生物学性状进行了研究分析。     

钙离子对曲霉原生质体的保护与促再生效应

研究了光照和黑暗条件下,钙离子浓度,处理时间对曲霉原生质体的保护和促再生效应。结果表明：黑暗下钙处理使原生质体数量比对照高,９ｈ处理比对照原生质体数量高达１．４３倍和１．６７倍,而光照下,钙处理反而使原生质体数量比对照低。黑暗下,不同浓度钙处理使黑曲霉原生质体再生提高１．４７倍到３．４０倍,使米曲霉提高１．０８倍到２．５８倍,二菌株钙促再生的最佳处理时间分别为２ｈ和４ｈ,最大再生率分别为２８．０８     

酿酒酵母和糖化酵母核倍性融合株的生长与生理特性研究

出发菌株是通过原生质体融合而获得的酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株ＨＵ－ＴＹ－１Ａ与糖化酵母（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）菌株５２０６－１Ｂ的不同核倍性融合株．经对其生长速率、生物量、耐渗性、耐酒精能力以及发酵力等的测定,表明均不同于原双亲株ＨＵ－ＴＹ－１Ａ和５２０６－１Ｂ;同时发现两株性状优异的四倍体菌株：４ＡＢ２－６０和４ＢＡ１－３．在３０℃培养时,其生长速率和生物量略高于亲株或与之相当,４０℃时明显高于双亲株,耐高渗、耐酒精能力高于５２０６－１Ｂ,与ＨＵ－ＴＹ－１Ａ相当;３０℃淀粉发酵与５２０６－１Ｂ接近,４０℃时则优于５２０６－１Ｂ;３０℃葡萄糖发酵,４ＢＡ１－３低于５２０６－１Ｂ,高于ＨＵ－ＴＹ－１Ａ,４ＡＢ２－６０则优于双亲株,４０℃时,４ＡＢ２－６０和４ＢＡ１－３均优于双亲株．同时我们还发现不同倍性的同株融合株之间存在一定的基因表达剂量效应．     

原生质体融合技术在烟草品种改良中的研究与应用前景

主要论述了原生质体融合技术在烟草品种改良中取得的成就,以及应用原生质体融合技术常采用的方法和存在的问题,讨论了原生质体融合技术在烟草抗生性育种上应用的前景。     

柱花草叶肉原生质体提取与瞬时表达体系构建

柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明：采用1.5%纤维素酶、1.25%离析酶、0.5 mol·L^-1甘露醇和4 mmol·L^-1MES酶解液组合,酶解时间为16 h时,原生质体的产量和活性均达到最佳,分别为(4.567×10⁶)个·g^-1和92.271%;原生质体浓度为(6×10⁵)个·mL^-1、质粒浓度为0.6μg·μL^-1,PEG-4000浓度为50%、转化时间为5 min时,转化效率最高,可达52.524%。构建了目标蛋白SgRKL1表达载体pA7-BIUTNT::SgRKL1-GFP,利用PEG介导法将其转入柱花草原生质体,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示SgRKL1蛋白定位于细胞膜上,说明所建立的柱花草叶肉原生质体瞬时表...     

原生质体载体技术在马铃薯育种中的应用

综述了原生质体载体技术在育种中的应用:体细胞杂交、以原生质体为受体细胞的DNA直接导入转化、体细胞无性系变异、胁迫耐受系的选择,同时针对马铃薯的生物学特性、育种现状及其原生质体方面的研究现状,提出利用原生质体载体技术进行马铃薯育种的优势和切实可行性。     

马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因克隆转化 及其转基因后代的表达

根据GenBank中的马铃薯卷叶病外壳蛋白基因(PLRV-CP)全序列，设计一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒RNA为模板，克隆了马铃薯卷叶病外壳蛋白基因，在pBI121的基础上构建了植物表达载体。利用PLO(Poly-L-Ornithine)将PLRV-CP基因导入到马铃薯加工型品种大西洋的原生质体中，获得了转基因后代。在5株转化后代中扩增出长度为610bp的目标DNA片断，说明导入的外源PLRV-CP基因已经整合到马铃薯基因组中。Southern blot分析结果进一步证明了PCR结果的正确性。RT-PCR结果表明，在3株转化后代叶片中具有阳性表达。马铃薯卷叶病毒接种实验结果表明，转基因植株比对照有明显的马铃薯卷叶病抗性     

棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立

以棉花幼嫩子叶为外植体材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为外植体材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L^–1甘露醇、20 mmol L^–1 KCl、20 mmol L^–1 MES、0.1 mol L^–1 CaCl₂和1.0 g L^–1 BSA等酶液,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×10⁶ m L^–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40% PEG(4000)介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。