专利文摘

申请（专利）号：CN200410018201．0 名称：吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 公开（公告）号：CN1569840 公开（公告）日：2005．01．26 申请（专利权）人：浙江大学 要：本发明公开了一种吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途。属于农药免疫化学技术领域。     

动物性食品中兽药人工抗原合成的研究

本文综述了兽药分子人工抗原合成中半抗原的设计原则、半抗原合成、载体选择、人工抗原合成方法、鉴定、纯化和影响因素等方面研究进展。     

二氯喹啉酸人工抗原的合成与鉴定

 以除草剂二氯喹啉酸（quinclorac，Q）、氯化亚砜、氨基己酸和氨基丁酸等为起始原料，经2步化学反应分别合成了2种二氯喹啉酸半抗原：6-(3,7-二氯-8-喹啉甲酰基)氨基己酸（QC）和4-（3,7-二氯-8-喹啉甲酰基）氨基丁酸（QB）。并通过碳化二亚胺法和混合酸酐法将Q、QC和QB分别与载体蛋白（BSA、OVA）偶联制备了二氯喹啉酸的免疫抗原和包被抗原。再将Q-BSA、QC-BSA和QB-BSA分别免疫新西兰大白兔获得了3种抗二氯喹啉酸的多克隆抗体：抗Q-BSA抗体(Q-Ab)、抗QC-BSA抗体(QC-Ab)和抗QB-BSA抗体(QB-Ab)，当相应的包被抗原浓度均为4 ?g·ml-1时，相应的冻干粉效价分别为2×103，1.2×106和1.6×106。由于Q-Ab效价偏低，不适合用于检测。采用同源间接ELISA竞争法测定时，其他2种抗体（QC-Ab、QB-Ab）的抑制中浓度(IC50)均大于50 mg·L-1，检测灵敏度也较低。因此本文对异源间接竞争ELISA法进行了研究，结果表明，异源反应的检测灵敏度高于同源反应，其中QB-Ab的IC50为0.4 mg·L-1；最低检测限为0.006 mg·L-1。     

2种不同无色孔雀石绿单克隆抗体的制备

【目的】制备无色孔雀石绿(LMG)单克隆抗体,并分析其生物学特性,为建立LMG残留的免疫学检测方法奠定基础。【方法】通过改进的碳二亚胺法制备无色孔雀石绿-牛血清白蛋白偶联物(LMG-BSA)与副品红-牛血清白蛋白偶联物(PA-BSA),用紫外扫描、质谱法方法鉴定偶联物。利用制备的LMG-BSA与PA-BSA作为免疫原,免疫4~5周龄Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备LMG单克隆抗体,并对其效价、亲和力、灵敏度和特异性等进行分析。【结果】LMG-BSA与PA-BSA的偶联比率分别为7∶1和37∶1;经间接酶联免疫吸附(ELISA)法筛选,由LMG-BSA和PA-BSA抗原各获得1株杂交瘤细胞,分别命名为L-1、P-1。这2株细胞株分泌的单克隆抗体纯化后,经测定效价分别为1.25×105和6.25×106,亲和力常数分别为4.92×109和1.44×108L/mol,半抑制质量浓度(IC50)分别达8.03和10.5μg/L。L-1分泌的单克隆抗体仅与孔雀石绿存在交叉反应,交叉反应率为100%;P-1分泌的单克隆抗体与孔雀石绿及副品红均存在交叉反应,交叉反应率分别为80%与100%。【结论】成功获得了2株LMG单克隆抗体,其均可用于水产品中LMG残留的快速检测。     

半抗原-载体蛋白偶联物的三种电泳鉴定方法

【目的】建立一种简单方便的半抗原-载体蛋白偶联物电泳鉴定方法。【方法】选用SDS-PAGE、非变性琼脂糖凝胶电泳、高效毛细管区带电泳3种方法对载体蛋白、偶联剂变性的载体蛋白、半抗原-载体蛋白进行比较鉴定,同时与光谱法结果比较。【结果】对分子量差异较小的载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物,SDS-PAGE不能有效分辨;但偶联前后载体电荷有变化时,非变性琼脂糖凝胶电泳却能有效分辨游离的载体蛋白和半抗原-载体蛋白偶联物,相对SDS-PAGE表现出更高的分辨灵敏度;毛细管区带电泳能高效分辨载体和半抗原-载体蛋白偶联物,结果直观,但需较贵重的专用仪器。琼脂糖电泳和毛细管电泳法与可见-紫外光谱法鉴定结果一致。【结论】3种电泳方法各有优缺点,非变性凝胶电泳简便、廉价、有效,较适合普通实验室使用。     

2种不同无色孔雀石绿单克隆抗体的制备

【目的】制备无色孔雀石绿（LMG）单克隆抗体,并分析其生物学特性,为建立LMG残留的免疫学检测方法奠定基础。【方法】通过改进的碳二亚胺法制备无色孔雀石绿牛血清白蛋白偶联物(LMG-BSA)与副品红牛血清白蛋白偶联物（PA-BSA）,用紫外扫描、质谱法方法鉴定偶联物。利用制备的LMG-BSA与PA-BSA作为免疫原,免疫4～5周龄Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备LMG单克隆抗体,并对其效价、亲和力、灵敏度和特异性等进行分析。【结果】LMG-BSA与PA-BSA的偶联比率分别为7∶1和37∶1;经间接酶联免疫吸附（ELISA）法筛选,由LMG-BSA和PA-BSA抗原各获得1株杂交瘤细胞,分别命名为L-1、P-1。这2株细胞株分泌的单克隆抗体纯化后,经测定效价分别为1.25×10⁵和6.25×10⁶,亲和力常数分别为4.92×10⁹和1.44×10⁸ L/mol,半抑制质量浓度（IC₅₀）分别达8.03和10.5 μg/L。L-1分泌的单克隆抗体仅与孔雀石绿存在交叉反应,交叉反应率为100%;P-1分泌的单克隆抗体与孔雀石绿及副品红均存在交叉反应,交叉反应率分别为80%与100%。【结论】成功获得了2株LMG单克隆抗体,其均可用于水产品中LMG残留的快速检测。     

浅谈青霉素在畜牧业的应用

青霉素是广谱抗菌素的一类半抗原药物,是从微生物的培养液中提取半合成的一种物质,能影响细菌的新陈代谢,破坏细胞壁的合成,以致影响其生长和繁殖,在畜牧兽医专业应用较广,可治疗各种细菌性感染和传     

Cd2+人工抗原的制备及其抗体特性

用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)鳌合Cd2+合成Cd-ITCBE半抗原,异硫氰酯法制备免疫抗原Cd-ITCBE-BSA,紫外分光光度法(UV)、SDS-PAGE和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行鉴定;用Cd-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠,间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,Cd-ITCBE-BSA偶联成功,Cd-ITCBE-BSA中BSA和Cd2+的含量分别为7.1g/L和191.7 mg/L;间接ELISA效价达到1∶(5.12×104),阻断ELISA检测Cd-EDTA的IC50为26.9μg/L,除与Hg-EDTA具有较强交叉反应外,与EDTA及其他金属离子鳌和物无交叉反应,获得高效价、敏感、特异的Cd2+pAb,为Cd2+残留免疫学检测方法的建立奠定基础。     

莠去津人工抗原的合成与鉴定

以除草剂莠去津原药、巯基丙酸等为起始原料,经过亲核取代反应合成了莠去津的半抗原:2-硫丙酸基-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪,并用UV、IR以及NMR等手段证明合成成功,用活泼酯法将半抗原与载体蛋白成功的进行偶联,根据紫外吸收的加和性原理,比较测定半抗原、载体蛋白及偶联物的吸光值,并计算出半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)的结合比为16:1和6:1。     

氯吡脲完全抗原的合成与鉴定

氯吡脲(Forchlorfenuron)是半抗原,只有将其与载体蛋白偶联形成完全抗原才能刺激机体产生抗体。以2-氯异烟酸为基础设计并合成了半抗原CPPU-H1和CPPU-H2,并采用活性酯法分别将其与载体蛋白偶联制备完全抗原;采用质谱和核磁共振对半抗原CPPU-H1和CPPU-H2的结构进行分析,并用紫外光谱法和ELISA法对完全抗原进行鉴定。结果表明,半抗原CPPU-H1和CPPU-H2成功合成,且合成后的CPPU-H1-BSA和CPPU-H2-OVA具有吸收峰叠加效应,表明CPPU完全抗原合成成功,其偶联比分别为16.8∶1和22.3∶1;间接ELISA测定4次免疫后小鼠血清效价最高可达1∶25 600。CPPU完全抗原的制备为抗CPPU抗体的制备及免疫学方法的建立奠定了基础。