中华稻蝗羧酸酯酶家族基因生物信息学及组织表达特异性分析

【目的】对重要农业害虫中华稻蝗（Oxya chinensis）羧酸酯酶（carboxylesterases,Ces）家族基因进行生物信息学分析,并对部分基因的组织表达特性进行研究,为揭示中华稻蝗Ces基因功能及研发新的分子靶标提供依据。【方法】基于中华稻蝗转录组数据库,通过关键词搜索获得Ces基因序列,采用生物信息学方法进行比对拼接、氨基酸序列推导和开放阅读框分析,选择全长序列构建系统发育树,采用在线软件分析中华稻蝗Ces氨基酸序列结构、理化性质、信号肽和N糖基化位点等特征。采用实时定量PCR技术,通过geNorm 与Normfinder 软件分析4个候选内参基因β-肌动蛋白（β-actin）、延长因子（EF1α）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和核糖体蛋白49（RP49）表达稳定性,筛选中华稻蝗5龄若虫不同组织部位最适内参基因并检测10个羧酸酯酶基因在不同组织部位相对表达量。【结果】从中华稻蝗转录组数据库搜索获得Ces基因cDNA片段180个,经筛选获得28个Ces基因全长序列进行生物信息学分析。推导的氨基酸序列与其他昆虫物种的聚类分析结果显示,中华稻蝗28个Ces分布于4个功能簇中,其中A簇直翅目和部分双翅目昆虫α酯酶（20个）、D簇表皮特异酯酶（2个）、E簇β酯酶（4个）和F簇非鳞翅目保幼激素酯酶（2个）。氨基酸序列分析结果显示,中华稻蝗大部分Ces的等电点（pI）均为偏酸性或弱酸性,pI为4.38-6.84,只有3个Ces的pI值偏碱性。中华稻蝗所有的Ces基因都具有N糖基化位点、N端保守的半胱氨酸残基及氧离子洞,信号肽预测结果表明19个Ces具有完整的信号肽;21个Ces具有典型的催化三联体S-E-H,其余7个Ces催化三联体发生了不同的替换。GeNorm与Normfinder分析结果显示,4个候选内参基因稳定性EF1α=RP49＞β-actin＞GAPDH。选择EF1α作为内参基因,RT-qPCR结果显示10个羧酸酯酶基因在7个不同组织部位均有表达,其中OcCesA1、OcCesA6、OcCesA12、OcCesA14、OcCesA18和OcCesA19在中肠和胃盲囊高表达,此外OcCesA6、OcCesA18和OcCesA19还在马氏管高表达,OcCesA2在后肠高表达。OcCesD1在马氏管表达量最高,脂肪体和表皮次之;OcCesE1在胃盲囊表达量最高;OcCesF2在中肠表达量最高。【结论】基于中华稻蝗转录组数据库获得28个全长Ces基因,聚类分析结果显示,这些基因分布于4个功能簇中,其中分布于A簇的基因数目相对较多,且多在中肠、胃盲囊和马氏管等代谢解毒器官中高表达。研究结果为Ces基因功能的深入探索和中华稻蝗Ces基因分子靶标研发提供了依据。     

块茎类植物酯酶对有机磷农药残留的检测

采用酶抑制法,选用五种块茎土豆、红薯、茨菇、芋头、莲藕提取植物酯酶,测定了总酯酶活力和比活力大小,结果显示土豆、茨菇、莲藕的酯酶活力分别高达8.462 3、8.743 7、7.491 0,显著高于其他几种。探索其检测有机磷农药的最佳条件,对5种有机磷农药进行了敏感性试验,并测定3种植物酯酶对这5种有机磷农药的最低检测限(LOD)。3种植物酯酶对受试的5种有机磷农药均有良好的敏感性,且最低检测限远低于国家规定的最大残留限量(MRL)。因此,这几种酶可作为有机磷农药残留检测用酶。     

铝胁迫对大豆同工酶的影响

采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳,研究了3个大豆品种在不同浓度铝毒害下,不同时期过氧化物酶同工酶(POD)和酯酶同工酶(EST)的变化情况。结果表明,在铝胁迫下,不同大豆品种,同工酶酶带有一定的差异。随着铝浓度的增加,各品种的酶活性和酶带数量变化不一,但总趋势为下降,这与各品种对铝的抗性密切相关。     

阿魏酸酯酶表达体系与酶蛋白拓扑空间结构分析

阿魏酸酯酶可通过打断阿魏酸和二聚阿魏酸等酚酸类木质素成分通过酯键与植物细胞中半纤维素分子形成的致密网状交联结构,进而促进栖居在草食动物胃肠道中微生物对所进食饲料细胞壁的降解效率。作者在分析和归纳总结了产阿魏酸酯酶菌株来源、筛选方法及不同表达体系的基础上,利用生物信息学的方法,对酯酶蛋白的拓扑空间结构、系统进化及作用机理方面取得的最新研究进展进行了阐述。     

稻褐飞虱羧酸酯酶基因的克隆与表达

以稻褐飞虱的cDNA为模板,进行PCR扩增,获得约1 900 bp的DNA片段.通过T-A克隆,将PCR产物插入pMD18-T载体中.再以此重组载体为模板,以羧酸酯酶成熟蛋白基因(cae-M)的特异性引物进行PCR扩增.将cae-M扩增产物和pET28a分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,酶切产物纯化后在T4连接酶作用连接成重组表达载体pET28a-cae-M.将pET28a-cae-M转化BL21(DE3),经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约62 kD外源蛋白带.蛋白质印迹分析表明,该外源蛋白与6×His融合表达.     

5种家蚕不同龄期酯酶同工酶的比较研究

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法分析家蚕不同发育阶段的酯酶同工酶谱。结果发现:5种家蚕的同工酶谱差异明显,并具有各自的特征谱带;苏.镇×春.光与陕蚕5号亲缘关系较近,可聚为一个类群;871×872与873×874亲缘关系最近,可以聚成一个类群。     

桑天牛成虫取食北京杨后血淋巴羧酸酯酶活力的变化

桑天牛成虫取食不同寄主植物以后,其寿命和产卵量明显不同。对羧酸酯酶活性测定表明,以桑树作为补充营养寄主的桑天牛成虫的血淋巴羧酸酯酶活力明显高于取食北京杨的天牛;而羧酸酯酶动力学研究表明,桑天牛取食北京杨后对其羧酸酯酶活性产生了一定的影响,因饲喂时间的不同,羧酸酯酶活性差异不同,5 d以内,酶分子的活力降低,至第7天时,除了活力降低外,酶分子的结构也发生了变化。     

分子标记技术在药用植物研究中的应用

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种比较理想的遗传标记技术。本文综述了几种常用的DNA分子标记技术的原理,特点及其在药用植物上的最新研究成果和进展,为准确、科学的评价药用植物的品质及真伪优劣提供可靠的依据,并对分子标记技术在药用植物研究上的应用前景进行了展望。     

酯酶同工酶染色的优化

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,测定鱼的酯酶同工酶,对已有染色程序进行改良,用KMnO4取代传统的坚牢蓝RR盐,溶于Tris-Gly(pH值8.3)中,达到了理想效果。     

多年生野生荞麦植株盛花期幼叶的酯酶同工酶研究

用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对荞麦属(Fagopyrum Mill)多年生植物5个种(含大粒组3个种和小粒组2个种)12份野生荞麦资源的盛花期幼叶酯酶同工酶进行了研究.结果发现,酯酶同工酶酶带18条,不同物种酶带数1到6条.系统聚类表明:荞麦属两个组(大粒组和小粒组)间遗传差异很大,而且F.megaspartanium在种内存在一定差异,但这种差异明显小于种间差异.