交叉中和血清1型和血清3型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备与鉴定

鸭甲型肝炎（duck hepatitis A,DHA）是危害养鸭业的主要疾病之一,是一种雏鸭的急性、高度致死性传染病。本研究旨在研制一种对我国流行的鸭甲型肝炎血清1型（DHAV-1）和血清3型（DHAV-3）病毒具有交叉中和作用的单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。人工合成12条DHAV-1和DHAV-3的VP1蛋白共有的抗原表位肽,分别与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）载体偶联作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠制备McAb。通过检测McAb与DHAV-1和DHAV-3的交叉反应性,测定McAb对病毒增殖的抑制效率、中和效价以及攻毒保护率等来筛选McAb。本研究共获得了12株稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株,其中6株（C1、C4、C7、C12、C13、C16）分泌的McAb同时与DHAV-1和DHAV-3发生特异性交叉反应; C1、C4、C7、C16可以抑制DHAV-1和DHAV-3在鸭胚中的增殖,抑制率在75.34%～100.00%不等;对DHAV-1和DHAV-3的中和效价：C1（1：3&1：5）、C4（1：3&1：3）、C7（1：10&1：11）和C16（1：9&1：9）;C7和C16对DHAV-1和DHAV-3攻毒雏鸭的保护率较高,分别为“70%、80%”和“100%、60%”。本研究成功研制出对DHAV-1和DHAV-3具有交叉中和活性的McAb 4株,其中2株对病毒的感染具有良好的预防效果,为DHA的防控提供了新材料和新思路。     

成年牦牛皮肤中血管与神经的组织学观察及HIF-1α在皮肤中的表达

本研究旨在探讨牦牛不同部位皮肤内血管和神经的分布情况,及检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）在不同部位皮肤上的定位及相对表达量,探究牦牛皮肤对高原低氧环境的适应机制。采用HE、Masson’s三色和Verhoeff VG染色法,对成年牦牛皮肤内血管和神经结构进行观察与分析;采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法,对HIF-1α的mRNA和蛋白在成年牦牛皮肤组织中表达与分布进行研究。结果表明,颈部血管与神经密度最高,前臂部和小腿部次之,跖部最低,部位间差异显著（P<0.05）。HIF-1α主要表达在表皮层、毛囊的上皮根鞘、皮脂腺、汗腺、血管、神经;颈部、前臂部和小腿部强阳性表达,跖部阳性表达。HIF-1α mRNA的相对表达量跖部明显低于其他部位（P<0.05）,其他三个部位两两比较差异不显著（P>0.05）。HIF-1α蛋白相对表达量颈部最高,跖部最低,差异显著（P<0.05）。研究结果提示,成年牦牛不同部位皮肤内不同血管和神经形态结构相似,密度从颈部到前肢再到后肢差异显著。HIF-1α的差异性表达进一步说明皮肤在牦牛适应低氧环境中发挥作用。     

NPFFR1基因对鹅卵泡颗粒细胞激素分泌和细胞凋亡的影响研究

神经相关肽受体（RFamide-related peptide receptor,NPFFR1）是促性腺激素抑制激素的主要亲和受体,它在调控动物繁殖方面起着重要作用。为了解NPFFR1对鹅卵巢卵泡发育的作用,本研究以42周龄健康产蛋四川白鹅为试验材料（n=9）,利用RT-qPCR法检测NPFFR1基因在等级前和等级卵泡颗粒细胞中的mRNA表达规律;在颗粒细胞中过表达NPFFR1基因,酶联免疫吸附法检测颗粒细胞上清液（n=9）中雌二醇（estradiol,E2）、孕酮（progesterone,P4）和抗缪勒管激素（anti-Mullerian hormone,AMH）的浓度变化,剩余贴壁细胞作一步法TUNEL检测细胞凋亡情况;转录组测序方法筛选大黄卵泡（8~10 mm）颗粒细胞过表达NPFFR1前后表达差异显著基因,并对差异表达基因进行功能聚类分析。结果显示,除F1等级外,其余等级卵泡颗粒细胞NPFFR1表达量均极显著高于等级前卵泡（P<0.01）;过表达NPFFR1后,等级颗粒细胞上清液中的E2和等级前颗粒细胞上清液AMH的含量显著（P<0.05）降低,但孕酮P4含量变化不显著（P>0.05）;转录组测序共筛选到267个差异表达基因（119个下调,148个上调）,这些基因主要富集在生物节律过程、繁殖进程等生物学过程中;同时,与对照组相比,差异基因AMH显著下调表达（P<0.05）,Clock（clock circadian regulator）、FOS（proto-oncogene,AP-1 trans-cription factor subunit）、Per（period circadian regulator）和ANTXR2（cell adhesion molecule 2）分别极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）上调表达。上述试验结果提示,NPFFR1可从激素、细胞凋亡和生物节律等多个环节影响卵泡颗粒细胞,参与调控卵泡的时序等级发育。     

猪C1QTNF3基因可变剪接体的鉴定及介导miR-101调控成脂分化的研究

旨在研究猪C1QTNF3基因可变剪接体的特性及miR-101通过C1QTNF3基因促进猪脂肪SV细胞成脂分化的机制。本研究采集3头30日龄健康马身猪仔公猪心、肝、脾、肺、肾、胃、股二头肌、腰大肌、皮下脂肪和背部脂肪组织样品,首先利用RT-PCR技术和生物信息学方法对C1QTNF3基因的不同转录本进行扩增和生物学特性分析,采用qRT-PCR技术检测C1QTNF3基因不同转录本在猪组织中的表达变化。随后,利用生物信息学预测发现,C1QTNF3上游的调控因子是miR-101,采用双荧光素酶报告试验验证miR-101对C1QTNF3的调控作用。最后,利用油红O染色和qRT-PCR技术检测过表达miR-101对猪脂肪SV细胞成脂分化的影响。基因克隆得到猪C1QTNF3存在两个转录本C1QTNF3和C1QTNF3-1,其中C1QTNF3-1为新鉴定的转录本;测序分析显示,与C1QTNF3相比,C1QTNF3-1的第1外显子区域缺失了219个碱基,少编码73个氨基酸。进化树分析显示,猪C1QTNF3和C1QTNF3-1蛋白序列与人和马来亚穿山甲等物种的亲缘关系较近。C1QTNF3和C1QTNF3-1在猪各组织中均有表达,且在各组织中C1QTNF3-1的表达量均极显著高于C1QTNF3（P<0.01）。过表达miR-101极显著下调C1QTNF3 3'UTR区域的荧光素酶活性（P<0.01）和C1QTNF3 mRNA的表达（P<0.01）,同时增加了脂肪细胞成脂分化关键基因PPARγ、C/EBPβ、SREBP-1c和FABP4的mRNA表达量（P<0.01）。本试验成功克隆了猪C1QTNF3基因的两个可变剪接体,其中C1QTNF3-1在猪不同组织中均高表达,推测该转录本为基因发挥功能的主要亚型。并深入研究了C1QTNF3基因的上游调控因子,揭示了miR-101靶向C1QTNF3促进成脂分化的机制,丰富了C1QTNF3的生物学作用和调控网络。     

过表达MyBPC1对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

旨在探究肌球蛋白结合蛋白C1（myosin binding protein C1,MyBPC1）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究MyBPC1在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。本研究利用西门塔尔胎牛原代牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型模拟牛骨骼肌的生长发育过程。采用qRT-PCR和Western blot检测MyBPC1的细胞时序表达谱。试验分为两组。在RNA水平每组4个重复,每个重复20 μL;在蛋白水平每组3个重复,每个重复15 μg。采用qRT-PCR和Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞转染MyBPC1的过表达效果,并进一步检测细胞增殖期标志因子Pax7、Ki67以及细胞分化期标志因子MyHC、MyOG的表达变化情况,观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态。结果,MyBPC1在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在极显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后MyBPC1的mRNA和蛋白表达量均极显著高于增殖期（P<0.01）。过表达MyBPC1后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,增殖标志因子Pax7的mRNA水平和蛋白表达水平无显著差异,分化标志因子MyHC的mRNA水平和蛋白表达水平极显著高于对照组（P<0.01）。过表达MyBPC1可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化,为进一步开展MyBPC1对牛骨骼肌卫星细胞的调控机制奠定基础。     

1株降解黄曲霉毒素B1的解淀粉芽胞杆菌的分离鉴定及其体外脱毒效果

旨在筛选出能够高效降解黄曲霉毒素B₁（AFB₁）的菌株,并对其脱毒活性组分的脱毒效果进行研究,本研究以香豆素为唯一碳源对目标细菌进行初筛,以对AFB₁的降解率为指标进行复筛,并从形态学、生理生化试验和16S rDNA序列分析对筛选菌株进行鉴定;通过测定该菌株不同发酵组分对AFB₁的降解率,来定位其脱毒活性组分,同时采用CCK-8法测定活性组分降解AFB₁后对LMH细胞毒性,并研究了热处理、紫外线照射、强酸、强碱及蛋白酶K处理对活性组分脱毒作用的影响。结果显示,从样品中初筛分离到24株能够在初筛培养基生长良好的菌株,经复筛从中筛选到一株能高效降解AFB₁的菌株Y1-B1,其AFB₁降解率达到73.2%;经形态学、生理生化试验和16S rDNA序列分析确定该菌为解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。对菌株Y1-B1培养物的不同组分进行的脱毒活性研究表明,不同组分对AFB₁的降解率不同,上清液的脱毒能力最强,细菌细胞裂解物的脱毒能力下降明显,菌体悬液和菌体裂解物上清的脱毒能力最差,由此确定解淀粉芽胞杆菌Y1-B1的脱毒能力主要来源于上清液中的某种活性物质;细胞毒性结果显示,与AFB₁对LMH细胞的毒性作用相比,AFB₁被上清液降解后其产物的毒性显著降低。该脱毒活性组分对不同理化因素处理呈现出不同的表现,对高温、紫外照射抵抗力较强,对强酸、强碱抵抗力较差,蛋白酶K仅造成脱毒能力部分减弱。本研究将为解决黄曲霉毒素污染问题提供新的微生物种质资源,同时为后续微生物脱毒制剂的开发奠定基础。     

口蹄疫病毒VP1基因密码子偏好性分析

VP1蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)的主要结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体以及激发保护性免疫应答。为探究VP1基因密码子偏好性,筛选出其最佳体外表达系统,使用Visual Gene Developer、CodonW、GraphPad Prism等软件,对VP1基因进行密码子偏好性分析,同时将VP1基因密码子使用频率与大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统作了比较。结果显示,VP1基因的CAI为0.21,ENC为55.43,GC3S为65.26%,表明该基因密码子使用偏好较弱并且密码子偏好以G/C碱基结尾。结合VP1基因与各表达系统密码子使用频率比值,发现其与昆虫杆状病毒表达系统频率比值差异最小且CAI最大,因此推断昆虫杆状病毒表达系统是FMDV VP1基因最适体外表达系统。本研究为FMDV亚单位疫苗研制等提供了技术基础。     

不同温度条件对桂蚕5号1~2龄人工饲料育的影响

为探索桂蚕5号1~2龄人工饲料育的最佳温度,通过设置不同的温度,调查24 h疏毛率、96 h 2龄起蚕率、192 h 3龄起蚕率、192 h 3龄存活率等发育整齐度指标和1龄眠蚕体重、2龄眠蚕体重等生长发育指标,分析桂蚕5号1~2龄饲料育的最适宜温度。结果表明,桂蚕5号1~2龄饲料育在28~32℃范围内发育比较整齐,如果从安全生产方面考虑,建议饲育温度控制在28~30℃为宜。     

驴小肽转运载体1基因的克隆、序列分析及组织表达研究

小肽转运载体1(PepT1)在动物肠道小肽的摄取过程中发挥重要作用。本试验旨在研究驴(Equus asinus)PepT1(ePepT1)基因的分子克隆、序列分析和组织表达。提取驴肠道组织总RNA,PCR克隆ePepT1基因片段,测序验证并进行序列分析;采用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)方法分别测定驴肾脏、脾脏、心脏、肝脏、肺脏、胃、十二指肠、空肠和回肠组织中ePepT1基因的相对表达量。结果表明:ePepT1开放阅读框为2 124 bp,共编码707个氨基酸残基。蛋白质理化性质预测显示,ePepT1蛋白分子质量为78.6 ku,等电点为7.52,具有11个跨膜区(TMD),且TMD 9和TMD 10之间有1个大的细胞外环;ePepT1蛋白有5个胞外N-糖基化位点,5个胞外蛋白激酶C(PKC)作用位点和3个蛋白激酶A(PKA)作用位点。组织分布研究发现,ePepT1基因在各组织均有表达,但在肠道(十二指肠、空肠和回肠)中相对表达量最高。综上所述,本研究首次克隆了ePepT1基因,研究了其组织表达规律,为进一步研究驴肠道小肽吸收提供了基础。     

溶血磷脂酸受体1-3在牦牛不同时期卵巢中表达定位

为探究正常生理下条件下溶血磷脂酸受体(LPAR)1-3在牦牛不同时期卵巢(卵泡期、黄体期、妊娠期)表达及生物学作用,利用RT-qPCR检测LPAR1-3基因在不同时期卵巢上的表达,同时利用蛋白质免疫印迹、免疫组织化学(IHC)等方法对LPAR1-3基因和蛋白的表达进行分析和定位。结果显示,LPAR1-3在牦牛不同时期卵巢上均有表达,其中LPAR1-3的表达量在妊娠期显著高于卵泡期和黄体期(P0.05),卵泡期表达量最低;在卵泡期、黄体期、妊娠期LPAR3的表达量均显著高于LPAR1和LPAR2(P0.05),LPAR2的表达量最低;IHC结果显示,LPAR1-3在卵巢生殖上皮、颗粒细胞、卵泡液、卵泡膜和黄体细胞均有表达。研究结果提示LPAR1-3可能在卵泡生长、发育、排卵以及维持妊娠等一系列生殖过程中发挥重要的作用,其中LPAR3可能在这一过程中起主要作用,该结果有助于对牦牛繁殖机能的进一步研究,可为高原哺乳动物生殖生理的研究提供理论依据。