RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布

【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位,建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV全序列,避开BVDV和BDV的同源区,设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）为参考毒株,在PK15细胞中培养病毒,加入RNA可视化原位杂交特异探针和相应试剂,采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素,采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间,建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术,并与FAT方法比较该技术灵敏度;用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终,以CSFV强致病力毒株（SM）接种PK15细胞,病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h(hours post inoculation,hpi)取样,每个时间点2个重复,采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布,同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位;当蛋白酶K浓度为1:1 000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件;灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200μL,比FAT高3.5个数量级;特异性试验结果显示该探针能与CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亚型结合,与BVDV、PPV、PCV-2、PRV无交叉反应。采用该技术对CSFV RNA感染后在靶细胞中的定位与分布研究结果显示:0.5hpi在胞核和胞浆均能检测到RNA,0.5-6hpi RNA主要分布于胞核内并在核内富集;10hpi胞浆内RNA逐渐增多,胞核内RNA逐渐减少,24hpi RNA主要集中在胞浆内细胞核周围;36hpi核外RNA大量聚集增多,72hpi达到峰值;96hpi RNA总量有所下降。而FAT结果显示：8hpi在少数细胞的胞浆内检测到病毒E2蛋白,10-24hpi蛋白表达数量一直较少;36hpi蛋白表达量不断增多,72hpi到最大值;96hpi荧光信号由强变弱。病毒蛋白在细胞浆内的聚集数量与细胞浆中RNA含量成正相关。【结论】首次建立了CSFV RNA可视化原位杂交检测技术,并对CSFV强致病力毒株在细胞中的RNA定位分布进行了研究,发现病毒RNA吸附和进入靶细胞的时间早于0.5hpi,观察到CSFV RNA有在细胞核内的生活史。     

关于贝类遗传改良几个问题的讨论

贝类大多为雌雄异体,少数种类是雌雄同体,在雌雄异体的种类也有部分个体表现为雌雄同体,而且雌雄异体型贝类还常有性转变现象。养殖贝类大多行体外受精并具有配子量大、子裔数量多等特点。野生型贝类表型方差大,遗传变异水平高。可见,贝类是一群比较独特的动物,其生殖方面的某些特性与作物的共同点甚至超过与高等动物的共同点。因此仅依靠脊椎动物或植物的育种方法,难以解决好贝类的种质改良问题。     

麦类作物DNA原位杂交及其在远缘杂种染色体分析中的应用

 应用生物素标记的物种基因组DNA探针和克隆的专化性探针，对六倍体小黑麦双二倍体及其杂种和八倍体小麦簇毛麦双二倍体及其杂种进行了染色体DNA原位杂交。结果表明，应用这两种探针均可以准确地检测出小麦远缘杂种中的异源染色体和染色体片段。先后对二个六倍体小黑麦双二倍体（Badger、M#-2A）、一个八倍体小簇麦双二倍体、三个小黑麦易位系（宁麦8026、Amigo、Apollo）、一个小黑麦代换系（84056）和二个小簇麦附加系（94009-5-4、94009-5-9）进行原位杂交和异源染色体的检测，均获得较好的结果。此外，还讨论了应用生物素标记的探针进行原位杂交可能出现的一些技术问题。     

茄子新品种‘哈茄V8’

 ‘哈茄V8’是由自交系‘12-1-3’为母本,自交系‘12-4-15’为父本杂交选育而成的黑长茄子新品种。果实长棒形,纵径28 cm,横径4.6 cm,平均单果质量160 ~ 180 g,平均产量54 771.7 kg · hm^-2,抗逆、抗病性好,适宜密植。适宜早春露地地膜和小拱棚栽培。     

湿地松与加勒比松杂交制种技术

广东省林业科学研究院系统开展湿地松（Pinus elliottii Engelmann）与加勒比松（P．caribaea Morelet）杂交育种的工作始于20世纪90年代。文章在以往杂交育种研究和实践的基础上,总结了一套加勒比松花粉的收集、处理、保存、人工控制授粉和球果与种子的收集、处理、贮藏等技术方法。该技术可为其它针叶树种的人工制种提供技术和方法上的参考。     

西门塔尔牛改良延边本地黄牛效果分析

为了研究西门塔尔牛对本地黄牛的改良效果。利用西门塔尔牛冻精为本地黄母牛人工授精,测定了3日龄、6月龄和12月龄西本F1公、母牛的体尺、体重、并与相应年龄性别的本地黄牛进行比较。结果发现：西本F1公、母牛各项指标均显著或极显著地高于本地黄牛,表明利用西门塔尔牛冻精杂交改良本地延边黄牛是切实可行的。     

黑籽南瓜种间杂交研究

通过调整播期克服了南瓜属种间花期不遇的问题,以美洲南瓜、中国南瓜、印度南瓜3个种共12个材料与黑籽南瓜进行了种间杂交试验。黑籽南瓜为母本不结实,以其他3个种为母本则均可结实。美洲南瓜×黑籽南瓜及印度南瓜×黑籽南瓜杂交获得的果实内均无种子。获得了18株中国南瓜×黑籽南瓜F1植株。种间杂种F1植株雄蕊退化,以其作为母本以中国南瓜或黑籽南瓜为父本进行回交,可结实但无种子。中国南瓜×黑籽南瓜F1形态为双亲中间型偏父本,其抗病性、抗虫性不及父本黑籽南瓜而倾向于母本中国南瓜。     

豇豆属食用豆类间的远缘杂交

【目的】明确豇豆属下不同食用豆种间的杂交亲和性,为开展豇豆属食用豆远缘杂交育种提供参考。【方法】以绿豆、小豆、黑吉豆、饭豆、豇豆5种主要的豇豆属食用豆栽培豆种和Vigna minima、Vigna nakashimae、Vigna riukiuensis 3种小豆、饭豆的近缘野生种为亲本,进行豇豆属下食用豆种间的远缘杂交,并对“绿豆×小豆”、“饭豆×小豆”、“小豆×饭豆”的杂种幼胚进行幼胚拯救。通过调查杂交成荚率和杂种F₁的农艺性状表现,分析豇豆属下不同食用豆杂交组合间的杂交亲和性。【结果】各食用豆种间亲缘关系的远近及母本的选择影响远缘杂交结果。除包含豇豆种的杂交组合外,其他食用豆种间正反交杂交组合均能够结荚,杂交荚和杂交籽粒的发育程度在各组合间存在差异。“绿豆×黑吉豆”、“小豆×Vigna minima”、“小豆×Vigna nakashimae”、“小豆×Vigna riukiuensis”4个杂交组合不存在受精前的遗传障碍,杂交成荚率较高,幼胚发育阶段存在不同程度的发育障碍,但均可以获得能够正常出苗的杂交籽粒,F₁ 植株结实率降低。绿豆和饭豆间正反交均能够结荚,但绿豆作母本时的成荚率显著高于饭豆作母本时的成荚率,且能够收获成熟的杂交荚和杂交籽粒。F₁植株高度不育,即使与绿豆或饭豆回交也均不能获得有活力的后代种子。“绿豆×小豆”、“饭豆×小豆”2个杂交组合不存在受精前的杂交障碍,然而在受精后幼胚生长阶段却存在发育障碍。通过幼胚拯救可以获得两者的后代植株,前者F₁高度不育,后者F₁可育,但结实率降低。其他杂交组合间存在杂交荚发育一段时间后干枯或掉落、杂交籽粒胚败育等现象,未能获得后代植株。【结论】绿豆作母本与黑吉豆、小豆、饭豆杂交更利于杂交荚和杂交籽粒的发育;黑吉豆与小豆、饭豆杂交时存在胚败育现象;饭豆作母本与小豆杂交经幼胚拯救可以获得可育的F₁植株;小豆与近缘野生种的杂交亲和性优于饭豆;豇豆与其他食用豆类间杂交均未成功。     

不同化学试剂和处理方式加倍小麦单倍体植株的效果

【目的】长期以来,小麦单倍体植株染色体加倍主要采用移栽前秋水仙素溶液通气浸泡分蘖节方法,该方法存在操作复杂、污染环境等问题,而且秋水仙素毒性较强、用量较大、价格较高。本研究的目的是建立小麦单倍体植株简便、安全、高效的加倍方法,寻找可以替代秋水仙素用于小麦单倍体植株加倍的化学试剂。【方法】通过小麦品系Fielder花药培养,小麦品种科农199、新春9号和小麦品系CB037、中国春（CS）与玉米自交系郑58杂交获得小麦单倍体植株,小麦品系中国春与甘肃黑麦杂交获得小麦-黑麦双单倍体植株,利用0、5、10和20 mmol·L^-1秋水仙素溶液分别采取分蘖节加注、叶片涂抹和培养基表面添加方式对不同来源小麦单倍体植株进行加倍,并采用培养基表面添加0、30、60和120 μmol·L^-1甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵溶液对小麦单倍体植株及小麦-黑麦双单倍体植株加倍,比较不同加倍方法和3种除草剂的加倍效果,确定各个加倍试剂的适宜浓度。【结果】不同浓度秋水仙素溶液（0、5、10和20 mmol·L^-1）加注小麦与玉米杂交单倍体植株分蘖节部位对小麦单倍体植株不具有加倍效果,不宜在小麦单倍体植株加倍中采用。10 mmol·L^-1秋水仙素溶液涂抹拔节期小麦单倍体植株叶片的加倍率为7.7%,其他3个秋水仙素溶液浓度没有加倍成功,也不适合小麦单倍体植株加倍。培养基表面添加4个浓度秋水仙素溶液处理小麦花药培养单倍体植株的加倍率分别为26.7%、42.9%、73.3%和85.7%。表明培养基表面添加秋水仙素溶液对小麦单倍体植株的加倍效果最好,适宜浓度至少为20 mmol·L^-1。培养基表面添加0、30、60和120 μmol·L^-1炔苯酰草胺溶液处理小麦与玉米杂交单倍体植株的加倍率分别为0、0-57.1%、28.6%-75.0%和0-100%,其他2种除草剂处理小麦与玉米杂交单倍体植株没有成功;培养基表面添加120 μmol·L^-1炔苯酰草胺溶液处理小麦与黑麦杂交双单倍体植株的加倍率为9.0%,添加其他3个浓度炔苯酰草胺溶液和其他3种加倍试剂均没有结实。【结论】60-120 μmol·L^-1浓度炔苯酰草胺溶液对小麦单倍体植株加倍具有较好效果,培养基表面添加适宜浓度秋水仙素和炔苯酰草胺溶液对小麦单倍体植株加倍有效,而且简单易行。     

凡纳滨对虾内质网膜转运通道蛋白基因Sec61γ的克隆及表达分析

以生长性状为指标分离凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei家系的肌肉组织,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,进行斑点杂交筛选获得内质网膜转运通道蛋白基因Sec61γ基因,克隆获得cDNA全长编码序列及部分非编码序列。序列包含270 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为89个氨基酸,预测的相对分子质量为10 300,理论等电点为10.58。通过荧光定量PCR的方法研究了Sec61γ基因在对虾不同组织和不同生长期肌肉组织中的表达情况,结果表明：Sec61γ基因在对虾的血液以及心脏、肝胰腺、肌肉、胃、肠、眼柄等器官或组织中都有表达,其中在肌肉组织中表达量最高,在肠中表达量最低;在对虾不同生长期肌肉中的表达量各不相同,在10日龄的对虾肌肉组织中表达量最高,为45日龄的对虾肌肉组织中表达量的27.6倍。