白菜叶缘裂刻近等基因系的cDNA-AFLP分析及SCAR标记的转化#br#

【目的】寻找与白菜叶缘裂刻发育相关的表达基因,了解叶缘裂刻调控的分子机理。 【方法】应用cDNA-AFLP技术从 mRNA 表达水平研究白菜叶全缘和裂刻近等基因系间基因表达的差异。【结果】共获得 57 条差异片段,合并归属于 55 条非重复序列,其中在叶全缘株系中增强或特异表达的有 25 条,叶裂刻株系中增强或特异表达的有 30 条。54 条差异片段可以在 NCBI 数据库中找到同源序列(包括 EST)、其中42 条为已知基因,1条没有找到同源序列。按照其参与的生物学途径归类,已知基因片段参与了代谢、转录、细胞囊泡运输、蛋白质合成和降解、蛋白质储藏与运输、信号传导、光合系统、基因转座等相关过程。用 AFLP 转化的 SCAR 标记在分离群体上验证结果表明,SEL7B16-SCAR 检测片段的表达模式与 cDNA-AFLP 结果一致。【结论】构建了白菜叶缘裂刻发育调控基因表达谱,识别了与已知NAC036、DP-2、MYB77、TCP24 参与调控裂刻发生基因密切相关的片段。基于cDNA-AFLP特异序列,开发了1条与裂刻紧密连锁的 SCAR 标记,命名为SEL7B16-SCAR,可用于裂叶纯合和杂合的分子辅助选择。     

大豆根组织受尖孢镰刀菌侵染后基因表达反应的cDNA-AFLP分析

 为了阐明大豆受尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum,Fo)侵染后在基因转录水平上的感病反应,本研究用cDNA-AFLP方法,对Fo浸根接种后大豆根组织进行了基因转录谱的银染法检测分析。结果表明,在测定的大约1 000个大豆cDNA扩增片段(TDFs)中,16个是差异性表达的,其中9个受Fo诱导上调表达,7个被抑制下调表达。对这些差异性表达的TDFs进行克隆、测序及其同源性进行分析,发现其中6个具有已知或推断的生物学功能,包括钙调素结合蛋白(CaMBP)、BURP结构域蛋白和羟基多花碱-羟基烷宁转移酶等,其余10个功能未知。这些可能参与大豆感病性的差异性表达新基因片段的发现,为开展大豆感病性功能基因组学研究提供了材料。     

特异茶树品种“紫娟”叶色转变的基因表达差异分析

利用cDNA-AFLP技术研究了特异茶树品种"紫娟"幼嫩叶片和成熟叶片的基因表达差异。从256对引物组合中获得59个差异表达带,其中在幼嫩叶片中获得26个上调片段,成熟叶片中获得33个上调片段。通过GenBank BLASTX比对分析,所获得的片段包括转录因子、代谢相关蛋白、信号蛋白以及一些假设蛋白、未知蛋白和没有比对的基因片段。利用RT-PCR对片段ZM4、ZM7、ZM12进行表达特性分析表明,ZM4、ZM7、ZM12均在成熟叶片中上调表达。这些研究结果将为深入研究理解"紫娟"茶树叶色转变的机理,以及相关基因克隆打下基础。     

大麦cDNA AFLP技术体系的优化及其应用

为构建适合分析大麦杂种优势的cDNA-AFLP技术体系,以4个大麦不育系、2个大麦恢复系以及按4×2配制的8个杂交种为材料,对影响大麦cDNA-AFLP技术体系的几个关键因素进行了研究。结果表明,大麦cDNA-AFLP技术按以下程序可得到多态性好的清晰条带:使用百泰克公司的TRIpure Reagent总RNA提取试剂可提取到高质量的叶片总RNA;用TaKaRa的M-MLV RTase反转录合成双链cDNA;用MseⅠ和EcoRⅠ酶切6h,再用T4连接酶15℃连接接头18h;预扩PCR反应的dNTP终浓度为0.2mmol.L-1,扩增20循环效果最好;预扩产物稀释20倍后进行选择性扩增,最终用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离条带。利用该cDNA-AFLP体系对参试杂交种及其亲本的谱带类型进行了分析,亲本与杂种之间共扩增出7种类型的谱带,分别是共同表达型(P1P2F1)、P1表达型(P1)、P2表达型(P2)、F1表达型(F1)、P2F1表达型(P2F1)、P1F1表达型(P1F1)和P1P2表达型(P1P2)。其中差异谱带类型可分为四种表达模式:(1)单亲显性表达型,包括P2F1表达(P2F1)和P1F1表达(P1F1);(2)单亲沉默表达型,包括仅P1表达(P1)和仅P2表达(P2);(3)杂种上调表达型,即仅F1表达(F1);(4)杂种下调表达型,即仅P1P2表达(P1P2)。     

利用cDNA-AFLP分析大白菜、萝卜及其杂交种差异表达基因

为更好地理解十字花科蔬菜杂种优势的分子机理,对大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)、萝卜(Raphanus sativus L.)及其杂交种的差异表达基因进行了初步研究.利用cDNA-AFLP技术对杂种F1及其双亲进行基因差异表达分析,共得到44个在杂种F1特异表达的差异片段,分属40...     

芍药种子cDNA-AFLP体系的建立

以芍药品种‘粉玉奴’与‘粉中楼’的杂交种子为试材,通过对影响cDNA-AFLP反应的重要因素进行优化,建立了适合于芍药种子的cDNA-AFLP分析体系,并对打破上胚轴与下胚轴休眠前后的种子基因表达差异进行了初步分析。结果表明：使用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒提取的RNA较完整;cDNA利用EcoRⅠ和MseⅠ进行双酶切37 ℃ 4 h,65 ℃ 20 min,酶切充分;连接产物稀释10倍用于预扩增;预扩增产物稀释10倍,取5 μL作为选择性扩增的模板,得到了较为清晰可辨的cDNA-AFLP谱带;打破下胚轴休眠前后约有3 700条差异条带,打破上胚轴休眠前后约有1 600条差异条带。     

番木瓜半胱氨酸蛋白酶基因CpCP的分离及表达分析

采用cDNA-AFLP技术分离了一个与番木瓜果实成熟衰老相关的差异片段,经生物信息学分析证实该片段属于半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease,CP）基因。将差异片段序列在NCBI中的番木瓜基因组序列中搜索,获得了半胱氨酸蛋白酶基因DNA序列。设计开放型阅读框上、下游引物,以木瓜果肉RNA逆转录的cDNA为模板扩增该基因全长cDNA序列,命名为CpCP（登录号：JN689334）。该基因属于C1肽酶家族中的C1A亚家族,编码471个氨基酸,含有家族特有的催化三联体：Cys166-His302-Asn322。Real-time PCR结果显示CpCP在果实中大量表达,是根、茎、叶、花中表达量的几十倍;CpCP受乙烯处理诱导,受1-MCP处理抑制,表达模式与番木瓜果实成熟衰老进程一致,说明CpCP参与了番木瓜果实成熟衰老进程。     

高丹草杂种及亲本叶片基因差异多样性研究

【目的】探明高丹草杂种及其亲本叶片基因差异的多样性。【方法】以4份高粱不育系和5种类型苏丹草为亲本,按照NCⅡ设计组配成20个杂交组合,测量各杂交组合及亲本的田间形态指标和生理生化指标,采用cDNA-AFLP差异显示技术分析其基因差异多样性,计算29份材料的遗传相似系数并进行UPGMA聚类分析。【结果】20份高丹草杂种及其9份亲本材料的cDNA-AFLP分析结果显示,12对引物组合共扩增出336个位点,其中特异性位点276个,占总数的82.14%,平均每对引物组合扩增出特异性位点23个。29份材料的观测等位基因数(No)为1.870 1,有效等位基因数(Ne)为1.736 5,Nei’s基因多样性指数(H)为0.389 8,Shannon信息指数(I)为0.556 9,显示了高丹草杂种及其亲本苗期叶片基因表达的复杂性。聚类分析结果显示,29份材料间的遗传相似系数为0.508~0.876,以遗传相似系数0.54为基准,可将29份材料分为4类,其中亲本材料主要在第Ⅰ类和第Ⅳ类,杂种主要在第Ⅱ类和第Ⅲ类。【结论】构建了高丹草cDNA-AFLP差异显示技术反应体系,表明高丹草及其亲本苗期叶片基因具有差异多样性。     

马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因候选表达序列的cDNA-AFLP鉴定

 利用具有6个无毒基因不同表现型且处于萌发中的静孢子时期的马铃薯晚疫病菌构建4个混合池, 通过cDNA2AFLP分析, 共获得85个与无毒基因相关的差异表达片段, 其中与无毒基因Avr1、Avr2、Avr3-Avr10-Avr11、Avr4 相关的差异表达片段分别为20, 28, 16和21个。将这些差异表达片段对20个晚疫病病菌个体进行无毒基因差异表达验证, 得到1 个无毒基因连锁群Avr3-Avr10-Avr11 的候选片段, 即A11T13Avr3-10-11S157; 无毒基因Avr4的候选片段2个, 即A24T19Avr4S122和A24T24Avr4S142。Blast分析表明: A11T13Avr3210211S157 与马铃薯晚疫病菌萌发孢子囊( germinating sporangium ) EST ( expressed sequence tag) 库中的序列PG001F10.XT7 同源; A24T19Avr4S122 与晚疫病菌萌发中静孢子( germinating cyst) EST库中的PH051G10.XT7部分序列完全一致, 而A24T24Avr4S142与PH051G10. XT7具有98%的同源性。这些结果将促进通过电子克隆并结合RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 技术获得全长的无毒基因Avr4。