苦楝SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

[目的]借鉴以往楝属文献报道的SSR引物,筛选高度多态性、稳定性高、重复性好的苦楝SSR引物,为苦楝遗传图谱构建、QTL定位和分子标记辅助选择育种等研究领域应用奠定基础.[方法]本研究采用单因素法和正交试验设计进行SSR-PCR反应体系优化,并利用该体系以8个不同种源的苦楝基因组DNA为模板,从135对候选SSR引物中进行引物筛选.[结果]苦楝SSR-PCR最优反应体系为:1.0 μL 50 ng·μL^-1模板DNA,1.2 μL 100 μmol·L^-1引物,1.0 μL 10 mmol·L^-1 dNTPs,0.8 μL 25 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.15 μL 5 U·μL^-1 Taq酶,1.5 μL 10×Buffer,补ddH₂O至15 μL;最终筛选出15对具有高度多态性、稳定性高、重复性好的SSR引物.[结论]本研究成功优化了苦楝SSR-PCR反应体系,并成功筛选出15对适用于苦楝的SSR引物.     

烟蚜两种微卫星标记银染方法的比较

实验比较了烟蚜SSR-PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳两种改良银染方法,目的是为初用者在选择银染方法时提供参考。用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测烟蚜SSR-PCR的产物,结果表明银染方法二灵敏度高、简便省时,更适于对烟蚜遗传多样性的研究。     

新疆野苹果SSR-PCR 反应体系的优化

以4个新疆野苹果株系为试材,利用CTAB法提取DNA,对影响SSR-PCR扩增结果的主要因子设计了多梯度的优化试验。结果表明:新疆野苹果SSR-PCR反应体系(25μL)中含Taq DNA聚合酶0.5 U、模板DNA 5.0 ng、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2+1.0 mmol/L、退火温度为60℃时效果最佳。最佳扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,65℃退火1 min,72℃延伸1 min,4个循环;94℃变性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。利用此反应体系对30份新疆野苹果进行SSR-PCR扩增和电泳检测,扩增谱带清晰且多态性较好,表明该体系适用于新疆野苹果的基因连锁图谱构建和QTL定位。     

药用植物金铁锁栽培研究现状

目的建立和优化金铁锁SSR-PCR反应体系。方法以金铁锁嫩叶为试验材料,采用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒、SDS法和CTAB法提取金铁锁DNA,并对提取结果进行比较。利用初筛并合成的20对金铁锁EST-SSR引物,对影响SSR-PCR体系的模板DNA、引物、Taq DNA聚合酶和dNTP用量这4个因素进行 L₁₆(4⁴)正交实验,从而建立较为稳定的金铁锁SSR-PCR反应体系。结果试剂盒法提取得到的金铁锁DNA质量最好且符合SSR分子标记试验;在20对金铁锁EST-SSR引物中,有2对可用于SSR多态性分析;各因素对PCR扩增效果的影响程度为引物>Taq DNA聚合酶>模板DNA>dNTP。试验最终确定的金铁锁SSR-PCR最佳反应体系(20 μL)：1.0 mL模板DNA(40 ng/μL)、1.5 μL引物(10 μmol/L)、0.3 μL dNTP (10 mmol/L)、0.3 μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)以及2.0 μL 10×PCR Buffer(含 Mg²⁺ 15 mmol/L),用ddH₂O补足至总体积20μL。结论所建立的金铁锁SSR反应体系可为金铁锁不同种群的遗传变异研究及杂交育种时亲缘关系的分子鉴定提供前期研究基础。     

甜菜SSR-PCR反应体系的优化

为了建立适宜甜菜的SSR反应体系,笔者以甜菜不育系TB005A为试验材料,研究了甜菜SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响。对SSR反应体系中的DNA模板浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度、dNTPs浓度以及退火温度进行了探索,确立了适合甜菜的SSR反应体系为;在20μL反应体系中,模板DNA为60ng,引物（50ng／μL）1．2μL,Taq DNA聚合酶1．0U,dNTPs（2、5mM／L）0．6μL。并利用该反应体系对30个甜菜不同品系进行SSR反应,用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同品系间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。     

大豆SSR-PCR反应体系优化

应用单因素试验和L16(45)正交设计对影响大豆SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适合大豆SSR-PCR反应的最佳体系。各因素不同水平对PCR反应结果均有影响,优化后的大豆SSR反应体系为:2.0 mmol/L Mg2+、1.00μmol/L引物、0.150 mmol/L dNTP、0.5 UTaq酶、50ngDNA模板。运用优化后的反应体系对大豆进行多态性引物的筛选,从140对引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物45对。     

东兴金花茶SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

采用L16（45）正交设计试验对东兴金花茶SSR-PCR反应的五因素（Mg^2＋,dNTPs,引物,Taq酶和模板DNA浓度）四水平进行了优化试验,然后利用优化后的反应体系,将31对同属植物SSR引物（4对茶树,7对山茶和20对金花茶引物）运用于东兴金花茶材料上,筛选适宜东兴金花茶遗传分析的SSR引物。结果表明,东兴金花茶最佳反应体系（15μL）及扩增条件为：Mg^2＋1.50 mmol/L、dNTP 0.30 mmol/L、引物0.40μmol/L、Taq酶0.75 U、模板DNA 40.00 ng;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s（因引物而异,该温度为引物CN10的退火温度）,72℃延伸40 s,共36个循环;72℃最后延伸10 min。山茶属的不同植物之间可以共享部分SSR引物信息,东兴金花茶获得了9对能扩增出条带清晰且具有多态性的引物,引物最适退货温度为54-60℃,观测杂合度（HO）和期望杂合度（HE）分别为0.433-1.000和0.391-0.932。本试验为下一步进行的东兴金花茶遗传多样性分析、遗传图谱的构建等研究奠定了基础。     

山生柳SSR-PCR反应体系优化

本研究以祁连山4个海拔梯度的山生柳（Salix oritrepha）为材料,采用L9(34)正交试验设计和单因子试验,分析山生柳SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,并对引物SHUK123的适宜退火温度进行优化。结果表明,PCR反应体系的最佳条件:20 μL体系中2.0 mmol·L-1 Mg2+ 1 μL,0.10 mmol·L-1 dNTPs 1.5 μL,0.5 U Taq酶用量为1 μL,20 ng·μL-1 DNA模板1 μL, 0.5 μmol·L-1的上下游引物各2 μL,10× Taq Buffer 2 μL,ddH2O加至20 μL。扩增反应程序：94 ℃高温预变性时间3 min,94 ℃变性45 s,Tm(不同退火温度)退火时间45 s,72 ℃延伸30 s,循环数30个,最后72 ℃后延伸时间5 min,4 ℃保温。适宜退火温度为56 ℃。以上结果表明,此反应体系在山生柳PCR扩增中的稳定性和可重复性较好。     

兴安落叶松SSR反应体系的建立与优化

采用L16(4^5)正交试验设计,对影响兴安落叶松SSR-PCR反应体系的主要因素(模板DNA、d NTPs、Mg^2+、Taq聚合酶浓度及引物浓度)进行了试验分析,其结果表明:兴安落叶松SSR-PCR体积为20μL的最佳反应体系是模板DNA用量50 ng、正反向引物浓度均为5μmol·L^-1、d NTPs浓度为2.5 mmol·L^-1、Mg^2+的浓度为2.5 mmol·L^-1、Taq聚合酶用量为1.0 U、最佳退火温度为60℃。试验所建立的反应体系可进一步用于兴安落叶松SSR遗传图谱构建、多样性分析、良种选育等方面的研究中。     

苹果SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立苹果属植物SSR-PCR反应优化体系,采用L16(45)正交实验和退火温度梯度实验,分析反应体系中使用的模板、引物、Mg2+、dNTPs以及Top Taq酶浓度对扩增产物的影响,并对这5个因素进行4个水平不同浓度梯度的筛选和优化.结果表明,引物浓度对SSR-PCR反应体系的影响最大,通过综合分析最终确定SSR-P...