多花黑麦草杂交种SSR分子标记鉴定及表型比较分析

多花黑麦草为异花受粉植物,杂交过程中易出现杂交种生物性混杂现象,有必要对杂交后代进行真假鉴定分析.本研究旨在筛选出多花黑麦草优势杂交组合和优异杂交后代材料,为多花黑麦草杂交育种工作提供基础资料.实验利用SSR分子标记辅助鉴定5个多花黑麦草(Lolium multiflorum)骨干品种为亲本创制的杂种后代真实性,并对亲本与杂种后代主要表型进行比较.结果表明:(1)用20对引物组合共得到多态性条带426条,多态性位点百分率为82.41％,说明SSR分子标记能够很好的揭示多花黑麦草材料间的差异;(2)经SSR分子鉴定,将后代分为有父本特征谱带的杂种后代、无父本特征带的后代2类,在150个杂交后代单株中有父本特征谱带的杂种后代有108个为真杂种,其中杂交组合GC、CG真杂种最多均为24个,WG组合真杂种最少为19个;(3)杂交组合CG的F1代部分形态特征显著优于亲本,5个杂交组合内(间)在营养器官与生殖器官性状均存在显著差异,其中杂交组合MG的变异系数最高,WG的变异系数最低,杂交组合CG形态特征显著高于其他杂交组合.由研究结果可以初步判断长江2号×赣选一号多花黑麦草为优势杂交组合,其杂交种为优异杂交后代材料,可为后续杂交选育新品系提供后备材料.     

致病疫霉基因组微卫星标记开发

致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病是影响马铃薯生产的第一大真菌病害.通过致病疫霉基因组开发微卫星标记,旨为致病疫霉群体遗传结构研究提供更系统、有效的标记.利用软件SciRoKo和ClustalX对致病疫霉基因组中微卫星序列长度≥25 bp的适合标记开发的位点及两端序列进行筛选.然后在这些位点的两端序列上设计专一性PCR扩增引物,选择9株致病疫霉菌对引物的专一性和微卫星的多态性进行检测.最后利用40株不同年份和地理来源的致病疫霉菌株对可行性微卫星标记进行等位基因数的确定及其多态性评估,然后选取部分标记对40株致病疫霉群体进行遗传多样性分析.共获得了33个具多态性的微卫星标记,占开发总数的28.7％,其多态信息含量(PIC)值都在0.164～0.614之间,其中PIC≥0.5的标记有7个,0.25 ＜PIC＜0.5的标记有25个,PIC≤0.25的有1个.发现致病疫霉微卫星基因型与其交配型及地理来源有一定相关性,与甲霜灵敏感性不相关.本研究开发出一批具有多态性微卫星标记,为致病疫霉群体遗传学研究机理提供更多多态性高,稳定性强的分子标记.     

马氏珠母贝生长性状与EST-SSR标记的关联分析

马氏珠母贝(Pinctada martensii)生长性状属于数量性状,为了筛选与马氏珠母贝生长性状位点连锁的分子标记,本研究利用50对多态性SSR引物对选系F4的90个个体的遗传多样性进行了研究,并利用SPSS16.0软件线性模型(GLM)进行了体质量、壳长、壳高和壳宽与标记的关联分析。结果表明,50对SSR引物在90个样本中共检测到204个等位基因,等位基因数(Ne)在2～9之间,平均等位基因4.080,有效等位基因数(Na)为2.574;观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)分别为0.534、0.543和0.491;共检测到15个SSR标记与4个生长性状具有显著相关性(P<0.05),其他35个标记与性状的相关性未达到显著水平(P>0.05);7个SSR标记与体质量显著相关(P<0.05),6个SSR标记与壳长显著相关(P<0.05),6个SSR标记与壳高显著相关(P<0.05),4个SSR标记和壳宽显著相关(P<0.05)。对同一标记不同基因型间进行多重比较,分别找到了4个性状的优势基因型。本研究筛选了与生长性状位点连锁的标记,为后续的分子标记辅助育种提供技术支撑。     

俄罗斯小麦籽粒硬度及puroindoline基因等位变异的分布

小麦籽粒硬度是重要的品质性状之一,对小麦加工品质具有重要影响.为了合理引进种质资源,培育高品质小麦品种,本研究利用小麦硬度指数测定仪JYDB100×40对引进俄罗斯小麦品种的籽粒硬度进行检测,利用STS标记和变温PCR对控制籽粒硬度基因puroindoline的主要等位变异进行分析.结果显示:208个俄罗斯引进小麦品种硬度指数范围为45.6 ～79.2,硬质麦品种为190个(91.35％),混合麦品种为18个(8.65％).Pina基因有Pina-D1a、Pina-D1b和杂合Pina-D1a/ Pina-D1b共3种类型,所占比例分别为87.02％、10.10％和2.88％.Pinb基因有Pinb-D1a、Pina-D1b、Pinb-D1c和双位点突变Pinb-D1bc 4种类型,所占比例分别为37.02％、55.77％、3.85％和3.37％.统计结果显示:携带Pina-D1b+Pinb-D1a基因小麦籽粒硬度指数显著大于Pina-D1a+Pinb-D1b,Pina-D1a+Pinb-D1a和Pina-D1a+Pinb-D1bc.其他puroindoline等位变异之间没有显著差异.俄罗斯硬质麦种质资源丰富,是改善我国小麦籽粒硬度和品质的重要遗传材料.     

基于iTRAQ质谱分析技术筛选南方型紫花苜蓿根部响应盐胁迫差异表达蛋白

为了从蛋白质水平上揭示南方型紫花苜蓿(Medicago sativa ‘Millennium’)适应盐胁迫的分子机制,本研究以30 d苗龄的南方型紫花苜蓿实生苗为材料,分析正常培养和250 mmol/L NaCl处理72 h后根中的蛋白表达变化,采用同位素相对标记与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合双向液相色谱与串联质谱(2-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D-LC-MS/MS)定量蛋白质组技术鉴定南方型紫花苜蓿根部响应盐胁迫差异表达蛋白,对所获得差异蛋白进行生物信息学分析,筛选出可能耐盐潜在靶标蛋白.同时,选择5个差异表达蛋白进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证.结果表明,共鉴定3 857种定量蛋白,534种差异蛋白(变化倍数≥1.2,P＜0.05),其中表达上调的281种,表达下调的253种.基因本体(Gene Ontology,GO)分子功能提示这些差异性蛋白主要参与转运活性、催化活性和酶调控活性.京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路显著性富集于代谢途径、次生代谢产物生物合成、苯丙氨酸代谢和核糖体等(P＜ 0.05,错误发现率(false discovery rate,FDR)＜ 0.05).成功鉴定的差异蛋白分别涉及到信号传递(8.99％)、抗氧化物(7.68％)、防御(5.61％)、蛋白质合成、加工和降解(14.79％)、能量产生与转运(5.81％)、代谢(26.97％)、膜与胞内运输(5.62％)和细胞结构、分裂和细胞骨架(2.06％)等.差异表达蛋白中与信号传递、抗氧化物和防御等相关的蛋白表达量总体上调,而与代谢和能量产生与转运相关蛋白表达量总体下调.qRT-PCR实验发现,mRNA与蛋白质表达水平并不一致.研究发现组氨酸磷酸转移蛋白、丝裂原活化蛋白激酶、h类硫氧还蛋白、蛋氨酸亚砜还原酶基因、鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate, GDP)解离抑制因子、脂质转移蛋白、β-1,2-木糖基转移酶和H2A/H2B/H3/H4核心组蛋白等可能是紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白.本研究采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS技术,有效地筛选出南方型紫花苜蓿根部响应盐胁迫差异表达蛋白,为深入认识紫花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制奠定了坚实的基础.     

大白菜InDels标记开发及其在剩余杂合体鉴定中的应用

大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)参考基因组序列的公布及测序成本的降低为大规模开发插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)标记提供了可能.本研究以性状差异明显的大白菜自交系He102与06-247为亲本,开展了全基因组重测序、标记开发和验证工作.二者测序深度分别为10×和8×,经筛选共获得330 218个InDels差异位点,出现频率为1.2个/kb,其中有11 238个差异位点位于编码区,包括5 184个差异基因,每个基因平均包含2.2个差异位点.分别以He102与06-247测序数据中筛选出的多态性InDels位点为参照,从10条染色体上随机选择933个位点进行了PCR扩增及电泳检测验证.结果表明,测序深度对假阳性率有直接影响,以测序较深的材料中筛选到的差异位点为参照,其验证结果的假阳性率亦较高,反之则较低.本研究中以He102与06-247为参照选择InDels位点验证的平均假阳性率分别是51.9％和22.5％.从933个位点中共筛选出593个在亲本之间实际表现为多态性的位点,这些差异位点中有375个位于编码区,是潜在的功能性标记.利用上述差异位点,检测了He102与06-247衍生的F7代重组自交系群体,明确了F7代各株系在593个位点的纯/杂合状态,为利用剩余杂合株系精细解析和精准定位大白菜耐抽薹、抗病毒、抗干烧心等重要农艺性状奠定了基础.     

基因差异表达技术cDNA-SCoT在植物上的研究应用

目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism,SCoT)分子标记是一种源于起始密码子ATG翻译起始位点保守区域来设计其侧翼单引物的标记技术.自从首次应用SCoT标记进行甘蔗(Saccharum officinarum)基因差异表达分析以来,该技术己被广泛应用于花生(Arachis hypogaea)、玉米(Zea mays)、铁皮石斛(Dendrobium officinale)、芒果(Mangifera indica)、西瓜(Citrullus lanatus)等植物的研究.本文介绍了cDNA-SCoT技术的原理、引物设计方法及特征,着重总结cDNA-SCoT技术体系筛选及其在抗病、抗寒、抗旱、遗传进化等方面的应用研究,以期为科研工作者在选择差异表达分析技术提供参考.     

我院承担的两个农作物生物技术研究项目通过结题验收

2008年1月17日,由我院生物技术研究中心承担的市科技攻关项目“主要粮食作物新品种DNA指纹图谱建立与应用”和市科技合作项目“玉米分子标记辅助选择及多抗性聚合育种技术研究”通过了市科委组织的专家验收。“主要粮食作物新品种DNA指纹图谱建立与应用”项目建立了玉米、     

“小麦/玉米/大豆”套作体系中不同作物间的相互作用及氮素的转移、吸收

在根系分隔盆栽条件下,采用15N土壤稀释标记方法,研究了“小麦/玉米/大豆”三熟套作体系不同作物间的相互作用及氮素的转移、吸收利用特性。结果表明,“小麦/玉米/大豆”套作体系促进小麦对肥料氮和土壤氮的吸收,不分隔处理的生物产量、15N总吸收量和总回收率得到显著提高,土壤残留15N丰度及总氮含量明显降低;玉米表现出套作优势（Awc<0,NCRwc<0）,不分隔处理的籽粒产量、籽粒15N吸收量、15N总回收率、土壤残留15N丰度及总氮含量较分隔处理提高17.17%、24.52%、17.63%、13.9%和10.1%;大豆表现出套作劣势,不分隔处理的15N总吸收量、籽粒15N吸收量、15N总回收率和土壤残留15N丰度降低,土壤总氮含量提高6.06%。“小麦/玉米/大豆”套作体系存在氮素的双向转移,以玉米向小麦、大豆向玉米转移为主。     

不同施肥处理对光合碳在花生-土壤系统中分配的影响

通过室内花生盆栽,设置NPK(常规氮磷钾施肥)、NPKS(常规氮磷钾加玉米秸秆)、NPKA(常规氮磷钾加腐殖酸)和CK(不施肥对照)4个不同的施肥处理,采用3次~(13)CO2脉冲标记的方法对不同施肥处理下光合碳在花生-土壤系统中的分配进行定量研究。结果表明:不同施肥处理对标记期内花生总生物量影响不显著,但是NPKA处理显著提升了花生根系生物量,较CK、NPK和NPKS分别高22.04%、19.47%和53.38%。NPKS处理地上部~(13)C丰度最高,但土壤中~(13)C丰度最低,NPKA处理土壤中~(13)C丰度最高。各处理地上部的~(13)C含量无显著差异,NPKA处理根系的~(13)C含量显著高于NPK且土壤~(13)C含量显著高于其他处理。NPKA处理地上部的~(13)C分配比例最低而土壤中分配比例最高,根系~(13)C分配比例与其他处理无显著差异,根系与土壤~(13)C分配比例之和显著高于其他处理。本研究表明腐殖酸能显著促进花生光合碳向地下部的转运。