PBP1基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化

将获得的拟南芥黑芥子酶结合蛋白PBP1基因表达载体pTYB2-PBP1导入大肠杆菌ER2566细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳显示,PBP1-CBD融合蛋白获得了较好的表达。进一步对PBP1蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳结果显示分离纯化效果较好,所获得的纯化的PBP1蛋白可进一步用于研究PBP1与MBP6的酵母双杂交技术。     

橡胶延长因子基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

[目的]制备橡胶延长因子重组蛋白及其多克隆抗体。[方法]用RT-PCR法扩增橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)编码区基因,将其克隆到原核表达载体pDEST17中,转化大肠杆菌BL21-AI,用L-阿拉伯糖诱导重组蛋白的表达,并采用亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA和W estern blot对抗体效价和特异性进行鉴定。[结果]高效表达和纯化了橡胶延长因子重组蛋白,用其免疫家小鼠,获得了高效价的特异性多克隆抗体,W estern blot检测显示该抗体可识别胶乳中的天然橡胶延长因子。[结论]成功获得橡胶延长因子重组蛋白,制备了效价高、特异性好的鼠抗橡胶延长因子抗体,为进一步橡胶延长因子及其他橡胶粒子膜蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒石河子株E2基因的克隆及其表达载体的构建

应用RT-PCR方法从牛病毒性腹泻病毒(BVDV)新疆石河子分离株中扩增了E2基因,命名Shihezi 148(GenBank登录号:EU159699),扩增序列分析结果表明:Shihezi 148 E2基因长度为1121 bp,编码373个氨基酸残基;同源性分析表明,Shihezi 148与澳大利亚Bega株E2基因核苷酸同源性为88.32%,与中国changchun 184株的同源性为74.42%;通过基因重组技术构建了去除C端跨膜区的截短E2基因的原核表达载体pProEX HTa-E2和包括信号肽和全长E2蛋白的真核重组质粒pVAX1-E2。经过PCR、酶切及测序结果表明pProEX HTa-E2和pVAX1-E2重组表达载体构建成功。     

赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因原核表达条件优化(英文)

[Objective] To optimize the prokaryotic expression of MCP gene of red-spotted grouper nervous necrosis virus. [Method] The MCP gene was amplified from red-spotted grouper nervous necrosis viral genome by RT-PCR. The recombinant expression vector pRSET A-MCP was constructed and transformed into BL21(DE3)plysS to express proteins with induction in different media, at different pH, or at different temperatures. [Result] The expression level of recombinant bacteria reached a peak with induction under the following condition: SOB or LB medium, pH 7.0, 37 ℃ while the fusion protein was about 44.5 kD in molecular weight. [Conclusion] This study provided a basis for the development of RGNNV-MCP vaccine.     

大豆查尔酮异构酶基因的克隆及粟酒裂殖酵母表达载体的构建

利用RT-PCR克隆Ⅱ型大豆查尔酮异构酶基因(CHI1A),然后将目的片段与克隆载体pMD18-T质粒相连接,检测后将目的基因重组于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的MCS序列之中,使用电击法将重组质粒转化进入粟酒裂殖酵母中,用PCR和双酶切的方法来检测试验结果,表明获得了CHI1A完整开放阅读框(670bp),与已报道序列(NO:AY595413)的同源性达到99%。PCR和酶切鉴定表明,CHI1A已导入到酵母表达载体中。查尔酮异构酶基因的克隆、粟酒裂殖酵母表达载体的构建,为该基因的应用提供了依据。有望利用基因工程技术将该基因重组于酵母基因组中并表达目的蛋白,以此来催化合成黄酮和异黄酮类化合物。     

小鼠FGF9在大肠杆菌中的表达与纯化

为了建立小鼠FGF9的原核表达体系,获得纯化的FGF9重组蛋白,采用PCR技术扩增FGF9,并将其克隆入原核表达载体pET30a(+)中,经测序验证后将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,采用亲和层析技术进行目的蛋白的纯化,并用Western blotting进行了免疫原性验证.测序结果显示插入到载体中的片段与FGF9的天然序列一致,在BL21(DE3)中表达出了可溶性的FGF9重组蛋白,其表达量达到总蛋白的40 %;用镍螯合亲和层析方法获得了纯度大于95 %的FGF9重组蛋白.     

草菇gpd启动子的克隆及表达载体的构建

从草菇基因组中克隆内源强启动子,为草菇基因工程育种提供启动子元件材料。［方法］采用PCR技术从草菇基因组DNA中克隆gpd启动子片段,利用生物信息学手段对其序列特征和调控元件进行分析,并构建表达载体。［结果］从草菇基因组中克隆出2条特异gpd启动子片段,大小分别为1056和614bp;成功构建了分别以这2条启动子片段驱动的、以gfp基因为报告基因的2个表达载体。［结论］该研究为进一步利用基因工程手段培育品质优良的草菇新菌株奠定了基础。     

陆地棉Ghkinesin13亚家族基因的克隆及表达特征分析

Kinesin家族是一类马达蛋白,它们能利用ATP水解所释放的能量驱动自身携带物质分子沿着微管运动,在细胞形成、细胞伸长等方面起着关键作用。本研究以拟南芥Atkinesin-13A蛋白序列作为探针序列,利用Blast比对从二倍体雷蒙德氏棉的基因组数据库中发现7个具有较高同源关系的基因。根据基因序列设计引物,利用RT-PCR技术从陆地棉纤维中分离出7个基因。依据7个基因与Atkinesin-13A和Atkinesin-13B的同源性高低,依次将其命名为Gh KIS13A1、Gh KIS13A2、Gh KIS13A3、Gh KIS13B1、Gh KIS13B2、Gh KIS13B3和Gh KIS13B4。生物信息学分析表明,7个Ghkinesin13均含有典型的KISC马达区域、ATP结合位点和微管结合位点,其马达区域属于中央马达。多重序列比对和进化树分析发现,这7个蛋白可被分为2个(Kinesin13A和Kinesin13B)亚类。实时荧光定量PCR结果表明,7个Ghkinesin13亚家族基因在棉花各组织中均有表达,但表达模式各不相同,其中Gh KIS13B4在纤维中优势表达,表明其在纤维发育过程中可能发挥着重要作用。     

梅花 PmAP2基因的克隆及表达1）

为了解析梅花（Prunus mume Sieb．et Zucc．）花器官发育的分子调控机理,采用RT－PCR的方法从梅花‘三轮玉蝶’中克隆了APETALE2的同源基因PmAP2,并采用荧光定量PCR对PmAP 2的表达模式进行了分析。序列分析表明,PmAP2基因CDS区域全长1647 bp,编码548个氨基酸,含有两个保守的AP2结构域,属于AP2／ERF基因家族。多序列比对和系统进化结果显示,该基因与桃、苹果AP2基因相似性较高,分别为96％和82％。PmAP2在梅花营养器官、四轮花器官和果实中均有表达,花瓣中的表达量最高;台阁花型梅花花中PmAP2表达量最高,重瓣品种次之,单瓣品种表达量最低。 PmAP2的差异表达可能与梅花的花型进化有关。