半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) miR-223的表达特征及免疫应答分析

microRNA(miRNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子,由具有发夹结构的70?90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成。本研究使用荧光实时定量PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)方法,研究了miRNA-223(miR-223)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)各健康组织、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后各时间点的免疫组织以及不同病原类似物刺激后头肾细胞中的表达模式。结果显示,miR-223在半滑舌鳎各组织中均有表达,在头肾中表达量最高,在脑和血液中的表达量极低。鳗弧菌感染3组样品4种免疫组织,miR-223表达变化显著,感染后20 h内,鳗弧菌诱导miR-223上调表达。鳗弧菌感染后半滑舌鳎免疫组织miR-223表达变化规律显示,鳗弧菌感染2、6、12、24、48、72、96和168 h后,miR-223在肝、肠、脾、头肾4种组织中出现差异表达。其中,miR-223在半滑舌鳎肝、脾、头肾中表达上调,在肠中表达下调。用LPS、poly I:C、PGN、RGNNV感染半滑舌鳎头肾细胞后,发现经LPS、RGNNV诱导后miR-223上调表达,poly I:C、PGN诱导后miR-223下调表达。研究结果表明,miR-223参与了半滑舌鳎免疫应答过程。本研究结果有助于了解miRNA在半滑舌鳎对病原刺激免疫应答过程中的作用以及半滑舌鳎与病原相互作用中miRNA参与调控的机制。     

小麦TaHTAS-5A基因的克隆、表达分析及亚细胞定位

非生物胁迫对小麦的生长发育具有不良影响,克隆与非生物胁迫相关的基因,并对其结构及表达特性进行分析,可以为进一步探索小麦的抗逆机制和抗逆育种奠定基础。本研究利用同源克隆技术从普通小麦品种中国春中克隆了水稻E3泛素连接酶基因OsHTAS的同源基因TaHTAS-5A(GeneBank登录号:MF967573),并利用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用qRT-PCR技术对该基因在小麦不同组织及不同逆境胁迫下的表达模式进行分析;同时,对该基因的表达产物进行了亚细胞定位。结果表明,小麦TaHTAS-5A基因含有220bp的5′UTR、1 242bp的ORF以及126bp的3′UTR,共编码413个氨基酸;基因组分析表明,该基因全长3 819bp,共包含4个外显子和3个内含子;缺体-四体定位表明该基因位于小麦5A染色体上;蛋白结构分析显示,TaHTAS-5A蛋白的N端包含四个跨膜结构域,C端包含一个E3泛素连接酶特有的RING finger保守结构域,具有植物E3泛素连接酶的结构特征;qRT-PCR结果显示,TaHTAS-5A对高温、低温和ABA都有响应,对干旱和盐响应不敏感;TaHTAS-5A在小麦的根、茎、叶和幼穗等不同组织中均有表达,但表达量有差异,在叶和穗中的表达量明显高于根部和茎部;亚细胞定位结果表明,TaHTAS-5A位于细胞膜上。本研究为进一步探究小麦TaHTAS-5A基因的功能奠定了基础,也为小麦非生物胁迫抗性改良提供了一定的理论依据。     

橡胶树类萌发素蛋白基因HbGLP01的克隆及其表达分析

类萌发素蛋白(GLPs)是一类重要的胁迫响应蛋白,参与植物的多种生理调控过程。试验前期通过cDNA-AFLP技术,从橡胶树转录组中筛选到一个与麻风树JcGLP(XM_012225699.1)高度同源的差异表达片段。在此基础上,通过基因预测和PCR扩增克隆到一个GLPs类基因HbGLP01。该基因包含2个外显子和1个内含子,cDNA全长696nt,编码231个氨基酸,预测蛋白分子量和等电点分别为24.8ku和5.54。同源比对表明,该蛋白与麻风树JcGLP1-13蛋白的同源性最高,达到81%。聚类分析研究表明,该蛋白与JcGLP1-13、胡杨PeGLP1-13及三角叶杨PtGLP等聚为一个分支。qRT-PCR分析发现,多主棒孢病菌侵染能诱导橡胶树HbGLP01基因的上调表达,其中高抗棒孢霉落叶病品种IAN873在侵染后24h时表达量达到峰值,高感品种PR107在48h后达到峰值,而且在IAN873中的表达峰值显著高于PR107。     

海南龙血树类黄酮3′-羟化酶基因(DcF3′H)的克隆与表达分析

类黄酮3′-羟化酶(Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)是植物黄酮类化合物骨架修饰途径中的关键酶之一,在形成结构多样化的黄酮类化合物中起重要作用。在前期已获得的龙血树转录组数据基础上克隆了1个海南龙血树F3′H基因,命名为DcF3′H。DcF3′H含有的开放阅读框长1 533 bp,编码510个氨基酸。推导的DcF3′H分子量为58 ku,等电点p I为6.59。DcF3′H含有细胞色素P450的保守结构域和CYP基序,与甘蔗、玉米、猕猴桃、小麦、烟草、黄瓜和大豆等植物的F3′H同源性分别为76%、75%、77%、74%、75%、76%和75%。进化树分析表明,DcF3′H与中国水仙亲缘关系较近,与苜蓿和鹰嘴豆的亲缘关系较远。荧光定量表达结果显示:DcF3′H在根、茎、叶、花和果等组织中均有表达,其中在花中表达量最高,根中表达量最低;无机盐诱导剂处理能显著提高DcF3'H的表达量,处理3 d时DcF3′H的表达量提高了5.58倍。此结果将为进一步研究海南龙血树类黄酮3′-羟化酶基因的功能奠定基础。     

芒果核苷二磷酸激酶(NDPK)基因克隆及表达分析

采用3′RACE和RT-PCR技术克隆芒果核苷二磷酸激酶基因全长c DNA序列,并用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式。结果表明:Mi NDPK1基因c DNA全长1 019 bp,开放阅读框为447 bp,编码148个氨基酸。Mi NDPK1蛋白定位于细胞质,无信号肽和跨膜区域,具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点;与麻疯树、橡胶树同源性最高为89%,与菠菜同源性最低为82%。Mi NDPK1在芒果各组织中均有表达,以叶片中表达最高,其次是花和果皮;在芒果进入生殖时期的花芽分化期表达量最高,此后在芒果果实发育进程中逐渐降低并趋于平稳。结合病害处理转录组样本中的差异性表达结果,推测芒果Mi NDPK1基因在花芽分化进程、抗病性诱导及免疫应答通路上发挥重要作用。     

橡胶树HAD家族蛋白酸性磷酸化酶基因VSP2的表达分析

植物营养储藏蛋白VSP2是HAD家族蛋白(haloalcanoic acid dehalogenase super family,HAD)的主要成员之一。该蛋白具有酸性磷酸化酶的功能,在橡胶树氮素储存和植物凝集素防御胁迫中发挥着重要的作用。在前期研究中,利用c DNA-AFLP获得了1条与橡胶树棒孢霉落叶病抗病性相关的差异表达片段EST-IAN-24,通过Blast比对分析,发现该基因片段与其他物种的VSP2基因具有较高同源性。采用PCR和RT-PCR技术,克隆获得了一个橡胶树VSP2基因的c DNA和基因组序列,并将该基因命名为Hb VSP2。基因序列分析显示,该基因编码区全长(CDS)975 bp,含有4个内含子和5个外显子,编码324个氨基酸,推测该蛋白的分子质量为30.01 ku,等电点为4.80。该基因蛋白是HAD家族蛋白中的酸性磷酸酶,具有DXDXT基序特征。q RT-PCR定量分析发现,受多主棒孢病菌侵染后,Hb VSP2基因在橡胶树抗、感品种中的表达量存在着明显的差异,抗病品种(IAN873)的表达量显著高于感病品种(PR107),且在接种12 h达到了峰值;此外,该基因在水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯的处理下均能诱导其表达,对茉莉酸甲酯的敏感性明显高于其他2个激素。本研究初步表明,Hb VSP2基因可能参与橡胶树与多主棒孢病菌的互作并且与抗病性相关。     

普通小麦春化处理过程中wcor14a基因的表达分析

为进一步完善普通小麦春化特性理论基础,从不同春化特性小麦品种RNA-Seq结果中筛选得到一个春化诱导上调表达的EST序列Unigene3230,经NCBI比对与小麦wcor14a基因序列一致。为进一步明确该基因在春化过程中的功能,利用荧光定量PCR分析了wcor14a基因在非生物胁迫下的表达特性,结果显示,wcor14a基因能够响应低温、ABA、干旱等非生物胁迫。对wcor14a基因在不同春化发育特性小麦品种中的表达分析表明,该基因在不同发育特性小麦品种中的表达总体表现为春性半冬性冬性强冬性,而且表达时间表现为冬性和强冬性早于春性和半冬性。     

橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因HbPPC1的克隆和表达分析

根据橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的部分序列设计引物,运用RT-PCR和RACE方法获得其家族成员的1个全长cDNA,命名为HbPPC1,长度3 025 bp,包含5′-UTR 34 bp,3′-UTR 93 bp,开放阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸。预测HbPPC1分子量为110.34 ku,理论等电点为6.09。HbPPC1具有C3型PEPC的结构特征,其N端第9~17位残基是可逆磷酸化的不变序列-X-X-SIDAQLR,C端倒数第4位残基为谷氨酰胺(Q),第774位残基为丙氨酸(A)。HbPPC1与5条大戟科植物的PEPC序列(其中木薯2条、蓖麻2条、麻风树1条)的同源性达到95％。系统进化分析表明,HbPPC1与这5条序列聚在同一个进化支中。HbPPC1包含2个酶活性位点和7种类型的Motifs,二级结构以由α-螺旋和无规则卷曲为主。Real-time RT-PCR结果表明,HbPPC1在橡胶树胶乳、叶片、树皮和花中均表达,在胶乳中的表达量最高;胶乳HbPPC1的表达受乙烯利刺激影响,在乙烯利刺激4~72 h后胶乳HbPPC1表达明显下调,表明HbPPC1在胶乳pH值调控中起重要作用。本研究结果为HbPPC1的功能研究提供理论依据。     

蒙古冰草MwDREB3基因的克隆及表达分析

以蒙古冰草(Agropyron mongolicum)为研究材料,利用同源序列法克隆得到1个DREB3类转录因子基因,命名为MwDREB3,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析MwDREB3 基因的表达特征,为蒙古冰草优异抗性基因的挖掘和利用提供理论依据.结果表明:该基因全长1056bp,包含1个完整的开放阅读框,长度为774bp,编码257个氨基酸,该蛋白近5'端含有1个保守的AP2结构域.系统进化树分析表明MwDREB3 编码的蛋白与小麦(Triticum aestivum)的DREB、山羊草(Aegilops columnaris)DRF1的进化关系较近.该基因在干旱、高盐、ABA诱导条件下,表达量上调;在低温条件下,表达量下调.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) miR-223的表达特征及免疫应答分析

microRNA(miRNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子,由具有发夹结构的70-90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成.本研究使用荧光实时定量PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)方法,研究了miRNA-223(miR-223)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)各健康组织、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后各时间点的免疫组织以及不同病原类似物刺激后头肾细胞中的表达模式.结果显示,miR-223在半滑舌鳎各组织中均有表达,在头肾中表达量最高,在脑和血液中的表达量极低.鳗弧菌感染3组样品4种免疫组织,miR-223表达变化显著,感染后20 h内,鳗弧菌诱导miR-223上调表达.鳗弧菌感染后半滑舌鳎免疫组织miR-223表达变化规律显示,鳗弧菌感染2、6、12、24、48、72、96和168 h后,miR-223在肝、肠、脾、头肾4种组织中出现差异表达.其中,miR-223在半滑舌鳎肝、脾、头肾中表达上调,在肠中表达下调.用LPS、poly I:C、PGN、RGNNV感染半滑舌鳎头肾细胞后,发现经LPS、RGNNV诱导后miR-223上调表达,poly I:C、PGN诱导后miR-223下调表达.研究结果表明,miR-223参与了半滑舌鳎免疫应答过程.本研究结果有助于了解miRNA在半滑舌鳎对病原刺激免疫应答过程中的作用以及半滑舌鳎与病原相互作用中miRNA参与调控的机制.