小金蝠蛾酚氧化酶原基因的克隆及表达分析

通过逆转录PCR技术克隆获得小金蝠蛾(Thitarodes xiaojinensis)幼虫酚氧化酶原(TxPPO)基因cDNA的部分序列,对其进行生物信息学分析及组织表达谱分析。克隆该基因cDNA所得的部分序列长度为2654 bp,其CDS全长为2 070 bp,编码的蛋白质由689个氨基酸残基组成,预测分子质量为79.31 ku、等电点为5.91,无信号肽。进一步对TxPPO氨基酸序列分析及系统发育树构建,发现该基因与其他鳞翅目昆虫酚氧化酶原-2(PPO2)聚为一支,同源性较高,相似度为62.45%～63.61%。此外,TxPPO含有与其他鳞翅目昆虫PPO相似的丝氨酸蛋白酶酶切位点、thiolester-like位点、3个保守的血蓝蛋白结构域、2个高度保守的铜离子结合位点及位于铜离子结合位点内的6个保守的组氨酸残基。通过实时荧光定量PCR及Western blot方法对PPO基因在小金蝠蛾幼虫各组织中的表达情况进行检测,RT-qPCR结果显示,该基因在小金蝠蛾幼虫的血细胞中转录水平最高,其次为头部、脂肪体、表皮、中肠组织;Western blot检测结果表明,该蛋白分布于小金蝠蛾幼虫的血浆、头部、表皮组织及中肠组织中,而未在脂肪体检测到其分布。     

白粉菌诱导下小麦TaNHO1基因的克隆、表达分析及亚细胞定位

非寄主抗性基因 NHO1(non-host resistance 1)编码的甘油激酶(glycerol kinase,GK),是甘油代谢中的限速酶之一,参与植物对多种病害的抵御过程。为进一步探究其响应小麦白粉菌侵染的表达模式,利用RT-PCR方法克隆获得了转录自抗病种质N9134的三个部分同源染色体的小麦 NHO1基因(分别命名为 TaNHO1-2A、 TaNHO1-2B和 TaNHO1-2D),分析三个 TaNHO1同源基因的序列、启动子组成元件和表达模式,并明确了其亚细胞定位。序列分析结果表明,小麦 TaNHO1-2A/2B/2D基因CDS区序列全长分别为1 605、1 599和1 605 bp,分别编码534、532和534个氨基酸残基;3个同源基因均含有与 AtNHO1(AT1G80460.1)基因以及 OsNHO1(Os04G0647800)基因高度相似的FGGY_N端和FGGY_C端结构域。经对启动子区结构分析,该基因启动子区含有大量与植物激素及逆境响应相关的顺式作用元件,意味着 TaNHO1可受到多种植物激素诱导并参与小麦抗病过程。qRT-PCR结果表明,在N9134抗病近等基因系响应白粉菌(Blumeria graminis f. sp.tritici,Bgt)侵染过程中,三个同源基因在不同时间点表达模式不同,其中 TaNHO1-2A、 TaNHO1-2B基因在侵染早期均上调表达,而 TaNHO1-2D则表现出多次波动的表达模式;在N9134感病近等基因系遗传背景下,同源基因的表达水平在病菌侵染后48 h均表现出下调,说明该基因能够响应白粉菌侵染。经亚细胞定位分析,该基因主要作用于细胞质、细胞膜以及核膜。     

木薯金属硫蛋白基因的克隆和表达分析

金属硫蛋白(metallothionein,MT)分子量小,半胱氨酸含量高,具有消除离子自由基,减弱重金属毒性和减少体内活性氧积累等功能。为探究木薯金属硫蛋白基因(MeMT)的原核表达能力和对活性氧的耐受性,本研究通过木薯cDNA克隆获取MeMT并将其连接至pET-28a,在BL21(DE3)菌株中成功诱导其表达。H2O2耐受性分析发现,与空载菌株相比,表达MeMT蛋白的DE3菌株对H2O2的耐受水平较高。RT-qPCR技术检测显示,在H2O2胁迫下,3 h时木薯叶片中MeMT的表达水平明显升高,但6 h时恢复甚至略低于对照组,证明MeMT在木薯中参与ROS应答过程。该结果对研究木薯抗逆性和产量的提高具有重要意义。     

日本结缕草ZjNAC1的克隆、转录激活活性、亚细胞定位及表达分析

采用RACE技术从日本结缕草中克隆得到ZjNAC1转录因子(GenBank No. MH428376),其开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。ZjNAC1编码的蛋白在N端有1个典型的NAM保守结构域,属于NAC转录因子家族。通过染色体步移的方法,获得ZjNAC1基因ATG上游1635bp序列,分析发现其包含响应脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)及逆境胁迫的作用元件。构建pGBKT7-ZjNAC1载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,发现ZjNAC1具有转录激活活性。农杆菌介导的35S-ZjNAC1-YFP载体注射本生烟草叶片瞬时表达结果显示,ZjNAC1定位于细胞核。实时荧光定量结果表明,ZjNAC1在日本结缕草根中表达量最高;此外,ZjNAC1的表达受10μmol/L MeJA和20%PEG4000处理的诱导,但受200μmol/L乙烯(ET)、10μmol/L ABA和300mmol/L NaCl处理的抑制。     

FHC基因的结构与功能及其表达调控的研究进展

铁蛋白为机体内贮存铁的可溶性蛋白,人血清铁蛋白是机体含铁量的间接标记物,用于诊断缺铁性贫血。铁蛋白重链1(FHC)是铁蛋白的一种亚基,在氧化应激、病毒性肝炎、肿瘤细胞、视网膜的保护、少突胶质细胞的成熟、猪蓝耳病等方面具有重要调控作用。本文就FHC基因表达调控及生物学功能进行综述,以期为该基因作为动物抗病育种的遗传标记奠定基础,为免疫治疗、癌症预防与监控等研究提供参考。     

贝莱斯芽孢杆菌的内切葡聚糖酶基因的克隆、表达及其酶学性质分析

本实验利用PCR方法扩增1株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)源的内切葡聚糖酶基因(CMCase),插入到p ET32a(+)中构建重组表达大肠杆菌系统,对重组内切葡聚糖酶基因进行生物信息学分析以及酶学性质研究。结果表明:内切葡聚糖酶由499个氨基酸组成,预测分子量为55.02 ku,最大开放阅读框ORF约为1 500 bp。经诱导表达优化后,培养上清中可检测到内切葡聚糖酶酶活力为5.81 IU/mL,菌体中为1.61 IU/mL,诱导后原菌液直接超声破碎处理可达7.41 IU/mL,其酶活力为野生菌株的2.3倍。重组内切葡聚糖酶具有典型内切纤维素酶的特征,其最适酶反应温度和pH分别为50℃和6,在60℃条件下放置1 h相对剩余酶活力可保持在70%以上,在pH 6～10范围内可保持90%以上。Na~+、Mg~(2+)可以促进重组内切葡聚糖酶酶活力,而Co~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(2+)等金属离子以及表面活性剂SDS则具有较强的抑制作用。由此可见,本实验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了内切葡聚糖酶,且该酶主要进行分泌表达,具有一定的耐热性和良好的pH稳定性。     

家蚕微孢子虫丙酮酸激酶基因的克隆与表达特征分析

丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)在糖酵解最后一步起着不可逆的作用,可以催化磷酸烯醇式丙酮酸将高能磷酸基团转移给ADP生成ATP和丙酮酸。通过在NCBI和家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)数据库中对丙酮酸激酶基因的比对分析,选择家蚕微孢子虫丙酮酸激酶M2亚型的一个基因(NbPK-2,GenBank登录号EOB11679.1)进行克隆。生物信息学分析显示,该基因序列长度为1 359 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码452个氨基酸,预测蛋白质等电点为7.13,相对分子质量为51.7 kD,没有信号肽;NbPK-2蛋白的二级结构预测显示其含有38%的螺旋、21%的延伸片段和40%无规则卷曲。通过qRT-PCR检测感染微孢子虫后家蚕不同发育时期的NbPK-2表达水平,发现该基因在感染后24 h内处于相对较高的表达水平,而此后表达水平开始降低,至144 h达到最低值,在168 h又有所升高。研究结果可促进对家蚕微孢子虫糖酵解途径的研究,为家蚕微粒子病的防控奠定理论基础。     

H5N1 亚型禽流感病毒NS1的克隆和原核表达

利用RT-PCR技术扩增了一株H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的NS1基因,克隆到pGEM T-easy载体上,经序列测定和分析正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体pET-NS1,阳性重组质粒转化BL21感受态细胞,用1mmol/L的IPTG诱导和SDS-PAGE电泳后获得了分子质量约为51ku的NS1融合蛋白。通过Western-blotting发现NS1蛋白可与H5N1亚型AIV单因子血清反应。为建立H5N1亚型AIV野毒株和疫苗株的特异性鉴别方法奠定了基础。     

Changes of BMP signaling pathway in mammary glands of mice with mammary hyperplasia

AIM: To determine the expression patterns of bone morphogenetic protein (BMP) signaling components in the mammary glands with hyperplasia (MGH) and the activation of this signaling pathway. METHODS: The female C57BL/C mice (8-weeks-old) were randomly divided into control group and hormone group with 15 mice in each group. The mice in control group were treated with PBS, while the mice in hormone group were intragastric administration with estradiol valerate (2.5 mg/kg) for 25 d, followed by progesterone (4 mg/kg) peritoneal injection for 5 d. At the end of treatments, the mammary glands were collected to determine the morphological changes, the mRNA expression of BMP signaling components and the phosphorylation level of Smad1/5/9. RESULTS: In MGH, a part of BMP signaling pathway molecules were differentially expressed (P<0.05), including BMP ligands BMP2, 4, 5, 6, 7, 9, 13 and 14, BMP receptor BMPR1A, and antagonists Chrdl1 and Twsg, whereas the expression levels of some molecules, such as BMP3, BMP12, BMPR1B, BMPR2, Chrd, Chrdl2 and Noggin, were not altered. The phosphorylation levels of Smad1/5/9 was up-regulated in MGH (P<0.05). CONCLUSION: BMP signaling pathway is activated in MGH through the abnormal expression of its components. BMP signaling pathway may be a new target for MGH therapy.