农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展

在水稻遗传转化过程中,农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多,比如转入的外源DNA结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等,已被广泛应用于转基因技术中。本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述,并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。     

天花粉蛋白基因导入欧美杨108

为获得含有天花粉蛋白（ TCS）的转基因欧美杨108植株,进行了植物表达载体的构建以及导入欧美杨108的研究。将北京大学惠赠的含有TCS启动子及结构基因的质粒pT1-3经SacⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样双酶切的载体pCambia1301用T4 DNA连接酶相连,转化大肠杆菌,构建植物表达载体pC-tPro-TCS。将构建的植物表达载体转入农杆菌LBA4404,采用农杆菌介导法,将其导入欧美杨108中。结果表明,共得到18个潮霉素抗性愈伤和抗性芽,转化效率为4．3％。抗性体经PCR和PCR-Southern检测,初步确认TCS基因已经导入到欧美杨108中。     

优化农杆菌介导的月季遗传转化系统的研究

为了建立月季品种‘萨蔓莎’根癌农杆菌介导的遗传转化系统，我们通过衡量GUS基因瞬间表达水平，探讨了各因子对基因转化的影响.结果表明:外植体、光照条件、共培养培养基中无机盐含量及乙酰丁香酮（AS）含量是重要的影响因子；共培养时间、共培养温度及农杆菌菌液浓度对根癌农杆菌的生长以至基因转化有重要影响.优化后的转化条件为:将月季胚性愈伤组织与OD６００值为0.5～0.8的农杆菌菌液侵染20min，然后在含300μmol/L AS并且无机盐减半的MS培养基上黑暗、23℃条件下共培养3d.      

农杆菌介导的小麦遗传转化研究进展

从转化的机理、应用现状、影响因素和应用前景4个方面对农杆菌介导的小麦遗传转化方法进行了综述。     

百脉根农杆菌快速高效遗传转化体系的建立

以百脉根品种“里奥”作为受体材料,以GUS基因为报告基因,研究了影响农杆菌介导的百脉根遗传转化的几种因素及表面活性剂(PEG 4000)、真空处理和乙酰丁香酮对提高转化效率的影响,建立了农杆菌介导的百脉根快速高效遗传转化体系,并获得了转基因抗性苗。结果表明,以子叶(带叶柄)为外植体,在OD600为0.5的菌液中,加入150 mg/L的PEG 4000,真空度6×10-2Pa,抽真空12 min,共培养3 d,转入含卡那霉素50 mg/L和羧苄青霉素300 mg/L的分化培养基中,约20 d后,50%的外植体分化不定芽,生根成苗。PCR初步检测表明有83%的植株为GUS阳性,转化率约为42%。     

Improvement of Plant Regeneration from Immature Embryos of Wheat Infected by Agrobacterium tumefaciens

Wheat, one of the most important food crops, has been extensively studied with respects to plant regeneration and transformation employing the immature embryos as recipient tissues. However, the transformed tissues often become severely necrotic after co-cultivation with Agrobacterium, which is one of the major obstacles in gone delivery. In this study, wheat varieties CB037, Kenong 199, Xinchun 9, Lunxuan 987, and Shi 4185 showed desirable culture potential or high infection ability in Agrobacterium-mediated transformation. Similarly, optimal regeneration conditions were determined by testing their ability to inhibit the cell necrosis and cell death phenotype. Two auxins of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D) and 3,6-dichloro-o-anisic acid (dicamba) were evaluated for highly significant effect on both callus and plantlet production, although they were genotype-dependent in wheat. Substitution of 2,4-D by dicamba enhanced the growth and regeneration ability of callus from the immature embryos of most genotypes tested. The callus growth state couldn't be modified by adding antioxidants such as ascorbic acid, cysteine, and silver nitrate or organic additives such as thiamine HCl and asparagine to the media. On the contrary, the best tissue statement and plant regeneration was achieved by employing the media containing the simplest MS (Murashige and Skoog) components and dicamba without organic components and vitamins. Thereby, our results are thought to inhibit wheat cell necrosis effectively and suggested to be used for more wheat genotypes.     

一种简易安全的从农杆菌和酵母中提取RNA的方法研究

[目的]设计一种简易安全的从农杆菌和酵母中提取RNA的方法。[方法]利用Triton X-100和SDS作为裂解液的主要成分,通过热激法裂解菌体,然后进行一系列的抽提、沉淀、洗涤,获得纯净的RNA;并用琼脂糖凝胶电泳及核酸检测仪检测总RNA的纯度、浓度及质量。[结果]该方法能高效裂解菌体,有效防止RNase污染,可以获得高质量的RNA。[结论]该研究成功的得到一种简易、安全提取农杆菌和酵母RNA的方法,为后续的基因表达分析奠定了技术基础。     

基于不定芽原位诱导的大豆转基因方法

建立了一种新型农杆菌介导的大豆转基因方法(专利公开号:102181479A),以萌发大豆为外植体,最大限度地保持了大豆植株的完整性,在非无菌环境下进行转化,利用草丁膦筛选阳性植株.该方法不需要组织培养,脱离了传统组培的限制.对16个大豆基因型进行转化,经PCR、RT-PCR、qPCR和GUS染色鉴定转基因株系,平均转化率为23％.获得当代转基因植株接近实生苗,收获种子仅需3～4个月.该方法将有利于促进大豆基因功能研究和规模化转化.     

导入抗逆基因的转双抗虫基因741杨的获得

为培育更多抗非生物胁迫的转基因杨树,以转双抗虫基因741杨(P.alba×(P.davidaiana×P.sirnonii)×P.tomentosa)为材料,建立了叶片诱导的转双抗虫基因741杨的高频再生体系,并采用根癌农杆菌介导法,探索了影响其遗传转化效率的主要因子.结果表明:最佳不定芽诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA;继代培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA,最佳生根培养基为1/2MS+0.05 mg/L IBA.对影响转化因子的研究结果表明,共培养时间为3d时,不定芽诱导率最高;共培养培养基加入乙酰丁香酮、pH值调到5.2时,诱导潮霉素抗性芽效果最显著;最佳潮霉素筛选质量浓度为3 mg/L;将抗逆基因AtNDPK2通过农杆菌导入到转基因741杨中,经PCR检测,在抗性植株DNA中扩增出与目的基因大小相同的片断,初步确认目的基因已经整合到转基因741毛白杨基因组中.     

桑树遗传转化的受体细胞及其再生

以近15年来国内外桑树遗传转化研究为主线,结合植物基因工程的研究动态,从分子生物学和细胞组织学方面阐述了桑树受体细胞与根癌农杆菌的相互作用和TDNA在感染细胞中的转移过程。用植物形态发生的基本原理分析了叶盘转化细胞再生的主要方式,并对植物细胞的感受态、农杆菌完成贴壁反应的先决条件、TDNA的穿壁通道进行了阐述。