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脂蛋白LPPQ是丝状霉形体丝状亚种SC型(MmmSC)非洲株、欧洲株和疫苗株所特有的。LPPQ N末端域具有良好的免疫原性,在牛体内可诱导产生强大、特异、早期、持续的免疫反应。本研究根据已发表的LPPQ基因序列设计引物,用Pyrobest^TM高保真DNA聚合酶从MmmSC HVRI X株中扩增出了LPPQ N末端基因序列,并进行了克隆与序列测定。核苷酸序列比较结果显示,HVRI X株的LPPQ N末端基因序列与国外发表的序列同源性为99.7%,由其推导的氨基酸序列同源性为99,1%,为脂蛋白LPPQ N末端基因体外表达奠定了基础。 相似文献
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结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达 总被引:3,自引:0,他引:3
以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 CFP10的成功表达为结核病诊断及重组疫苗的构建打下了基础 相似文献
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从动物耳皮肤组织采样 ,采用将组织块剪碎后直接贴附于培养瓶底部的方法进行原代培养 ,该方法使原代细胞出现率及可传代率均达到 10 0 %。根据上皮样细胞和成纤维样细胞贴壁紧实程度的不同 ,用 0 .0 5 %的胰蛋白酶-EDTA对其进行消化 ,可将两种不同类型的细胞进行分离和纯化。通过脂质体介导 ,以BLG -hINS(含乳球蛋白调控基因的人胰岛素原基因 )基因作为目的基因、GFP(绿色荧光蛋白 )基因作为标记基因共转染绵羊成纤维细胞 ,经G - 4 18筛选后 ,得到转染细胞。对转染的细胞分别用单细胞显微操作法和有限稀释法进行细胞克隆 ,两种方法均可得到克隆细胞。选形态正常、生长均匀的 5个细胞克隆进行PCR检测 ,结果 5个克隆均转有GFP基因 ,其中两个转有BLG -hINS基因。高代培养细胞、转染细胞和克隆细胞经核型分析后 ,染色体数目均为 2 7对 ,表明绵羊耳的成纤维细胞建立细胞株后 ,可以作为外源基因转染的有效供体细胞。 相似文献
65.
根据环形泰勒虫TaA1272-1株裂殖体表面抗原(TaSP)基因的序列设计了1对引物,用PCR扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段(SBxp)。将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上,转化入大肠埃希氏菌JM109中进行克隆。随后将重组质粒pGEM-SBxp和表达载体pGEX-4T-1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后,将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体pGEX-4T-1-SBxp,并将其转化到BL21宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后,阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blotting检测。结果,SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达,其表达产物为分子质量43ku的融合蛋白,该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。 相似文献
66.
phyA基因的克隆及其新型表达载体的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
直接以黑曲霉菌株F246基因组为模板,对植酸酶基因phyA的成熟肽(分子长度为1347bp)进行了PCR扩增,再将PCR产物克隆入pMD18-T质粒,经DNA测序鉴定正确后,亚克隆入表达载体pET30a^ 和pMG36e,成功构建了phyA基因2种新型表达载体。植酸酶phyA基因2种新型表达载体的构建,为进一步获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生态制剂打下了基础。 相似文献
67.
对从含有鸡毒霉形体H3株TM-1基因的大肠埃希氏菌DH5α中提取的质粒,进行EcoR Ⅰ和Sα/Ⅰ双酶切,获得了大约为786bp的目的片段。将此片段与经EcoRⅠ和Sαl Ⅰ双酶切的线性原核表达载体pET-30a-1连接。转化宿主菌BL21(DE3),筛选阳性克隆。提取质粒,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入正确,从而构建成了重组表达载体。阳性克隆用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,证明其分子质量约为29ku;Western-blotting分析表明,该蛋白可被鸡毒霉形体阳性血清识别,具有生物学活性。 相似文献
68.
根据已发表的大肠埃希氏菌F18ab菌毛F亚单位(FedF/ab)的基因(fedF/ab)序列,设计了1对引物,利用PCR技术从大肠埃希氏菌F107/86、YCED1、YCED2、C、D和12F株中分别扩增获得了一段序列,并克隆至pGEM—T载体,获得了重组质粒TF107F、TYCED1F、TYCED2F、TCF、TDF、T12FF。经琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析,6个重组质粒的大小均为903bp,与fedF/ab基因大小一致。其中大肠埃希氏菌F107/86、YCED1、C和12F株的fedF基因序列完全相同;只有YCED2株在第181位碱基处存在1个C→T的无义变异差异,D株在第655位碱基处存在1个T→C变异差异并在氨基酸水平出现1个S→P变异。结果表明,所克隆的序列均为F18ab菌毛F亚单位的基因。 相似文献
69.
以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34 kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc.GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测.结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应.OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础. 相似文献
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