蛋白翻译后泛素化修饰在精子发生中作用机制的研究进展

泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System,UPS）是真核细胞内蛋白质降解的2种主要机制之一。在精子发生过程中许多蛋白质和细胞器被降解，UPS在促进精子形成的过程中起着关键作用。在精子发生的减数分裂、顶体生物发生和精子成熟等关键阶段，泛素相关成分（包括去泛素化酶）发挥着积极作用。一般来说，UPS功能障碍会阻止精子发生，这可能会在不同程度上诱发不育。许多UPS成分可以在不同水平上调节精子发生。本文综述了精子发生过程中泛素化修饰研究进展，为后续研究提供新的见解。     

叶用莴苣无缝克隆构建LsE3基因过表达载体和新RNAi载体及遗传转化体系优化

研究旨在应用新技术和新载体构建过表达和沉默载体,优化遗传转化体系,验证生菜LsE3基因功能,探究高温抽薹机制。以pCAMBIA1304和pFGC5941载体为材料,通过无缝克隆构建叶用莴苣转基因载体,并通过筛选培养基配方优化遗传转化体系。试验成功地以pCAMBIA1304为基础,插入源自pFGC5941的dsRNA表达框序列,获得了新RNAi空载pCAMBIA1304- FGC5941,构建了LsE3沉默载体,并成功以双元质粒载体pCAMBIA1304构建了LsE3过表达载体。试验对易抽薹叶用莴苣品种‘GB-31’进行潮霉素浓度、直接芽诱导培养基配方和生根培养基配方的筛选,确立了潮霉素适宜筛选浓度为5 mg/L,并确立了最优培养芽诱导和生根培养基配方。试验成功获得新RNAi空载并构建了转基因载体,优化了遗传转化体系,为解决载体构建繁琐复杂的问题提供新思路,并奠定了生菜转基因技术的基础。     

Ccr4-Not复合物的生物学功能研究进展

文章综述了Ccr4-Not复合物的组成、结构、功能以及与病毒和疾病相关的研究进展，为深入了解该复合物提供参考。     

高粱高效Ubiquitin启动子的克隆及活性鉴定

在转基因植物的研究中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一。植物泛素（ubiquitin）基因启动子以启动效率高、甲基化程度相对较低、遗传性状稳定等特点成为单子叶植物中应用较为广泛的启动子。其中，玉米的Ubi-1是最常使用的Ubiquitin启动子之一。本研究旨在克隆高粱高效Ubiquitin启动子，为高粱及其他单子叶植物的遗传转化研究提供新的组成型启动子选择。本研究从NCBI数据库中查找到多个polyubiquitin基因，下载其起始密码子上游3000 bp的序列。根据Ubiquitin启动子的特点，选择含有5′ UTR内含子且大小合适的序列，并通过在线启动子预测网站进行启动子分析，最后选择2个基因（LOC8076096、LOC8063786）进行启动子克隆，将其启动子序列分别命名为U1和U5。将这2个启动子片段PCR扩增后，连入含有GUS报告基因的植物表达载体Ubi-GUS，得到重组表达载体U1-GUS和U5-GUS。重组载体通过农杆菌介导法转化水稻和狗尾草，PCR筛选阳性转化苗，对阳性转化苗进行GUS染色分析，鉴定U1和U5的启动子活性。GUS染色观察发现，所有以U1和U5为启动子的水稻和狗尾草阳性转化苗的根、茎和叶均呈现较深的蓝色，比以玉米Ubi-1为启动子的阳性转化苗的蓝色略深，且以U5为启动子的阳性转化苗比以U1为启动子的蓝色更深，而非转基因的水稻和狗尾草小苗则完全染不上蓝色。因此，启动子U1和U5在水稻和狗尾草中均具有组成型强启动子的活性，可作为新的组成型启动子应用于高粱、水稻、狗尾草及其他单子叶植物的遗传转化研究。     

桑树MaUBC-C基因的表达模式分析及原核表达

泛素结合酶E2（ubiquitin-conjugating enzyme, UBC）在植物中具有重要的作用，参与植物的生长发育、逆境胁迫、免疫响应等生理活动。本课题组前期通过分析桑脉带相关病毒（Mulberry vein banding-associated virus, MVBaV）侵染的桑树品种‘桂桑优62号’（Morus atropurpurea）转录组获得了上调表达的基因MaUBC-C。为探究泛素结合酶MaUBC-C基因的功能，本研究以‘桂桑优62号’桑树为材料，克隆MaUBC-C的CDS序列进行生物信息学和表达模式分析，并对其进行原核表达获得该蛋白。结果显示，MaUBC-C编码区全长为567 bp，编码蛋白含188个氨基酸，大小为21.03 kDa，属于亲水、酸性、不稳定的核定位蛋白，具有保守的UBC结构域。将其氨基酸序列与其他物种的UBC氨基酸序列进行比对和进化分析，发现MaUBC-C与川桑MnUBC-C的相似性最高为98.40%，且具有最近的进化亲缘关系。荧光定量PCR分析MaUBC-C基因表达模式，结果显示MaUBC-C在桑苗的根、茎、叶中均有表达，其中在根部表达量最高，分别是茎和叶的1.24倍和1.71倍；对外源激素（ABA、GA、MeJA、SA）和非生物胁迫（低温、高温、高盐、干旱）处理均产生响应，且在ABA和MeJA处理下表现出显著上调，在24 h时的表达量分别为正常水平的29.55、9.05倍，推测MaUBC-C在桑树的生长发育中具有广泛的调控作用，参与桑树的激素信号转导和对非生物胁迫的防御反应。利用无缝克隆技术构建MaUBC-C原核表达载体pET-30a-MaUBC-C并转化大肠杆菌BL21，0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下进行诱导，获得约为25 kDa的融合蛋白，与预期大小相符，为今后进行MaUBC-C基因功能研究提供了基础材料。本研究为进一步探究桑树泛素蛋白酶体途径的作用机制奠定了基础。     

甘蔗E3泛素连接酶基因PRT1的生物信息学及表达模式分析

为探究甘蔗PROTEOLYSIS 1(PRT1)基因与黑穗病菌的互作关系，以甘蔗割手密种和栽培品种为研究对象，通过RT-PCR技术对ScPRT1(GenBank登录号：MT747433)基因进行克隆，生物信息学分析、定量PCR、亚细胞定位和基因共表达网络分析。生物信息学分析表明，该基因的cDNA全长为1 621 bp,包含一个长度为1 260 bp,编码419个氨基酸的完整开放读码框；其编码蛋白的分子量为46.56 ku,为酸性、不稳定的亲水蛋白，无信号肽，具有核定位信号；该蛋白包含2个RING结构域和1个ZZ结构域；ScPRT1蛋白的高级结构元件多为无规则卷曲。定量PCR结果显示，ScPRT1在皮、叶片、芽中的表达量相差不大，在蔗髓中表达量最高。同时该基因的表达受脱落酸胁迫后显著上调；受黑穗病菌胁迫后，在甘蔗抗黑穗病品种中上调表达，在感黑穗病品种中下调表达，都达到了显著水平。亚细胞定位结果揭示，ScPRT1定位于细胞核。寄主甘蔗和病原黑穗病菌的基因共表达网络中，与甘蔗ScPRT1共表达的黑穗病菌基因中，有3个为N端具有芳香族氨基酸残基的黑穗病菌效应蛋白，这暗示它们之间存在直接的相互作...     

VPS28通过泛素化信号通路调控奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白的合成

旨在分析VPS28基因调控乳蛋白合成的分子机制，为奶牛泌乳性状的分子育种奠定理论基础。本研究首先利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术敲降奶牛原代乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）中VPS28基因的表达水平，检测与乳蛋白合成、泛素化-溶酶体和泛素化-蛋白酶体通路相关的11个基因、泛素蛋白的表达水平及蛋白酶体活性；然后抑制BMECs中蛋白酶体和溶酶体的活性，检测酪蛋白相关基因、核糖体蛋白的表达水平；最后利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）比较蛋白质组学分析敲降前后BMECs的差异表达蛋白。结果表明，敲降VPS28基因后，CSN1S1、CSN2、CSN3、RPS8、UBC、PSMC3、PSMC5基因均显著上调，PSMD12显著下调；抑制蛋白酶体后，CSN1S1、CSN2、CSN3显著上调，RPL13显著下调；抑制溶酶体活性后酪蛋白相关基因表达不显著；iTRAQ结果共筛选出129个差异表达蛋白，下调蛋白主要富集在核糖体、溶酶体、剪切体等相关通路，上调蛋白主要富集在内质网的蛋白质加工、加压素调控的水重吸收过程、RNA转运等通路中。研究表明，VPS28基因可通过泛素化信号通路影响BMECs中乳蛋白的合成。     

小麦Ta4CL1基因的克隆及其在促进转基因拟南芥生长和木质素沉积中的功能

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL; EC 6.2.1.12)位于苯丙烷途径分支点的上游,是苯丙烷代谢途径的核心酶,可产生木质素、黄酮类等化合物,这些化合物对植物的生长发育及环境适应性均具有重要作用。在双子叶植物中,有关4CL的研究较多,而在单子叶植物尤其是作物中的研究相对较少。本研究利用RACE技术从普通小麦中克隆了一个4CL基因Ta4CL1。系统发育分析表明,Ta4CL1与水稻、玉米和高粱等植物中在木质素合成中具有重要作用的4CLs聚成一类;利用Ta4CL1过表达、拟南芥4CLs突变体at4cl1、at4cl3和at4cl14cl3及其功能回复株系进行的分析表明,Ta4CL1与At4CL1功能相似,在植物木质素合成中具有重要作用,但未参与黄酮类化合物生物合成的调控过程;Ta4CL1是转基因拟南芥中4CL酶活性的主要贡献者。过表达Ta4CL1的转基因拟南芥叶片增大、茎更粗; Ta4CL1的表达还受茉莉酸甲酯(Methyl jasmonic acid, MeJA)、赤霉素(Gibberellin, GA)和生长素(Indoleacetic acid, IAA)等激素处理的影响。本研究为利用...     

桑树4CL基因家族的筛选和Mm4CL2的功能研究

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase)是苯丙烷类代谢途径中的重要限速酶。在川桑基因组数据库的基础上利用全基因组筛选方法鉴别出6个Mn4CL同源基因，命名为Mn4CL1～Mn4CL6。蛋白质功能域分析发现6个Mn4CL蛋白均包含保守结构域BoxⅠ和BoxⅡ,都属于ANL酶超家族。系统发生分析表明，Mn4CL1、Mn4CL2、Mn4CL4与已报道的参与木质素生物合成的4CL聚类在一起，属于第Ⅰ类；Mn4CL3属于第Ⅱ类，参与黄酮类化合物的生物合成；Mn4CL5和Mn4CL6属于4CL类似蛋白。以此为基础，从湖桑32号叶片中克隆出一条长为1 641 bp的cDNA序列，命名为Mm4CL2,构建重组质粒pET-28a-Mm4CL2并成功诱导表达出Mm4CL2蛋白。初步的酶学活性分析发现Mm4CL2蛋白能够分别催化香豆酸、咖啡酸和阿魏酸形成其相应的肉桂酰CoA,而不能催化芥子酸。本研究初步鉴定出一个桑树4CL基因Mm4CL2,为基因工程定向选育低木质素的桑树品种提供了新的候选基因。     

胡萝卜4CL基因家族的鉴定及分析

旨在全基因组水平上鉴定胡萝卜 4CL基因，揭示该基因家族成员的理化性质、系统进化、基因结构、组织表达模式及胁迫响应情况，为胡萝卜 4CL的功能研究和利用奠定基础。基于AMP结合结构域(PF00501)的隐马尔可夫模型文件，利用HMMER软件对胡萝卜蛋白质数据库进行检索，获得胡萝卜 4CL基因(命名为 Dc4CL);利用ProtParam分析 Dc4CL的理化性质；利用MEGA6对Dc4CL进行系统进化分析；使用GSDS2.0、MEME分析 Dc4CL的基因及蛋白结构；利用荧光定量PCR技术对 Dc4CL的组织表达模式及胁迫响应情况进行研究。结果表明，胡萝卜基因组中存在12个 4CL基因，分别为 Dc4CL1～ Dc4CL12。 Dc4CL基因开放阅读框(ORF)长度为1 350～3 363 bp,编码蛋白质长度为449～1 120 aa,编码蛋白的分子质量和等电点分别为48.92～123.73 ku和5.34～8.82。系统进化分析表明，Dc4CL与其他来自水稻、拟南芥、二穗短柄草、高粱、大白菜的4CL蛋白可分为两个类群。结构分析表明， Dc4CL基因外显子数目为4～11个，其蛋白序列...