基于抗原表位策略的苹果茎痘病毒抗血清的制备

苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)是一种严重危害果树生产的潜隐性病毒,但缺乏实用的ASPV抗血清。应用不同生物信息学软件对ASPV外壳蛋白不同区域的抗原指数、蛋白二级结构中α螺旋、β片层、β转角、无规则卷曲结构、亲水性、可塑性(Flexibility)和表面可及性(Surface probability)进行了分析。根据抗原表位主要分布在β转角结构和无规则卷曲区域、亲水性和表面可及性参数较高的特点,综合分析预测ASPV外壳蛋白抗原表位区可能位于N端6-20、100-114、400-414位氨基酸残基附近。通过合成2条多肽(CRGYEEGSRPNQRVLP、CTGGKIGPKPVLSIRK),与载体蛋白偶联后免疫动物,最后得到了2份抗血清(编号为1468和1469)。制备的抗血清可与ASPV外壳蛋白基因原核表达产物产生免疫反应。应用此抗血清检测苹果样品,抗血清1468检测结果与RT-PCR检测结果一致,而抗血清1469仅能检测到部分样品。     

用2种偶联比率偶联蛋白质制备猪抗克伦特罗血清的比较

将同窝断奶1周左右的仔猪分为2组，用偶联比率为1：14和1：18的2种BSA-CL偶联蛋白BSA14和BSA18分别免疫3次后，采用间接ELISA、间接抑制ELISA测定抗血清效价和血清阻断率。结果表明，虽然BSA18组血清的稀释度（1：20000）低于BSA14组血清的稀释度（1：40000），但血清阻断率明显高于BSA14组。提示以BSA为载体蛋白制备抗CL血清时，偶联比率在1：20左右较好。     

牛IgG轻链的分离纯化及其多克隆抗血清的制备

实验应用凝胶过滤和盐析等方法直接从牛初乳中分离纯化IgG,并应用化学方法断裂回收IgG轻链。分离纯化获得分子量约27.66 ku的IgG轻链蛋白溶液,蛋白质含量为0.105 mg.L-1,浓缩后免疫家兔,获得抗轻链抗血清,效价>11∶6,免疫双扩散和免疫电泳均为特异性条带,表明得到了纯化的IgG轻链及其特异性抗血清。     

多羟基双萘醛(WCT)抗血清的制备与不同酶联免疫吸附检测法的对比试验

通过对多羟基双萘醛分子式上的醛基的改造,利用混合酸酐法使小分子化合物多羟基双萘醛能够与大分子蛋白质BSA相结合,形成人工抗原,注射兔子,成功制备WCT抗血清。通过ELISA检测,血清的效价为1∶256,非专化性效价为1∶2。本试验比较了酶联夹心法和间接酶联法的灵敏度,发现间接法检测WCT的灵敏度比夹心法相对高,这为应用间接法检测WCT提供了依据。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆、表达及其抗血清的制备

本试验通过设计并合成1对引物,PCR扩增B型产气荚膜梭菌C58-2株α毒素完整成熟肽序列,并将其插入到pGEM-T Easy载体中,构建克隆载体pGEM-T-α。对克隆载体pGEM-T-α进行EcoRⅠ和Hind Ⅲ的双酶切,将得到的1125 bp片段以正确的阅读框架定向克隆于pET-28a(+)中,然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys宿主菌中,37 ℃、1.0 mmol/L IPTG诱导该片段获得良好表达。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白约为46.1 ku,与预期大小一致。Western blotting结果显示,该重组α毒素蛋白可被A型产气荚膜梭菌定型血清识别,表明该重组α毒素蛋白具备与天然毒素相似的反应原性。重组α毒素蛋白在菌液上清、超声波裂解上清和超声波裂解沉淀中均有分布,且以包涵体表达为主,表明重组α毒素蛋白可同时在胞外、周质和胞浆表达。小鼠毒力试验结果表明,重组α毒素蛋白不具有毒性。毒素—抗毒素中和试验结果表明,该抗血清具有α毒素特异性。以重组α毒素蛋白作为抗原免疫家兔制备血清,效价测定结果表明每1 mL重组α毒素蛋白抗血清可以中和100 MLD的A型毒素。     

猪穴位免疫鸡IBV疫苗后猪血清中抗鸡IBV抗体效价的变化

在猪后海穴注射免疫鸡IBV疫苗,应用间接血凝抑制试验(HI)观察免疫后不同时间猪血清中抗体效价的变化趋势。结果:仔猪50日龄、57日龄、71日龄分别强化免疫IBVH120灭活苗3次后,血清中HI效价逐渐增高,二免后7天达17log2,较常规颈部肌肉注射免疫猪高2-3log2;育肥猪分别在130、138、146、151日龄时进行4次H120、H94强化免疫,随着免疫次数的增多,血清HI效价逐渐增高,但不如仔猪的增高明显。结果说明猪穴免疫鸡IBV苗后,猪能对鸡IBV产生特异性免疫应答反应,且后海穴免疫引起的免疫应答较非穴位强。     

小麦黄花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的衣壳蛋白(CP)基因,将其连接原核表达载体p EHISTEV,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达38 k D的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白,免疫新西兰长耳兔,制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048,Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应,而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。     

拟南芥Ran2小GTP结合蛋白抗血清的制备及其FITC荧光标记

将原核表达、纯化的Ran2蛋白对新西兰兔进行免疫制备抗血清,ELISA测定其效价为1∶51 200。免疫印迹分析表明,原核表达、纯化的Ran2和拟南芥可溶性蛋白杂交带均在26 ku处。FITC荧光标记抗体检测Ran2绿色杂交带主要出现在细胞分裂间期的核膜上。     

Cloning,Expression of Clostridium perfringens α-toxin Gene and Preparation of its Antisera

One pair of primers had been designed and synthesized based on the α-toxin gene of Clostridium perfringens.The complete α-toxin gene fragment was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and then was cloned into pGEM-T Easy vector to construct pGEM-T-α.Digested with EcoRⅠ and Hind Ⅲ, a fragment of 1125 bp was cloned into the expression plasmid vector pET-28a(+).The recombinant plasmid was transformed into the BL21(DE3)plys and induced by 1.0 mmol/L IPTG at 37 ℃.The expression product was found to be 46.1 ku as expected one identified by SDS-PAGE, and confirmed by Western blotting with Clostridium perfringens type A antisera, indicating similar reactivity with native α-toxin.Recombinant α-toxin protein was simultaneously found in culture supernatant, postsonic supertanant and inclusion bodies, most protein was expressed in inclusion bodies, which indicated recombinant α-toxin protein was expressed in the extracellular, periplasm and cytoplasm.Recombinant α-toxin protein in postsonic supertanant could not make mice die, indicating its non-toxicity.Toxin-antitoxin neutralization test showed that antisera of recombinant α-toxin protein were specific to α-toxin.Upon immunization of rabbit with the recombinant α-toxin protein, antisera with high antibody titer neutralizing 100 MLD toxin per 1 mL were prepared.     

嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpK的原核表达、抗原性分析及抗血浆杀菌作用研究

[目的]本文研究了淡水养殖主要病原菌嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpK的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础.[方法]采用生物信息学分析OmpK蛋白的理化性质、结构与功能;利用分子克隆构建OmpK蛋白表达菌株,结合L9(34)正交实验确定其最佳诱导表达条件,通过包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化OmpK蛋白;West...