在水稻纹枯病菌菌核形成中5个基因的表达差异分析

以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1IA)菌株GD118不同生长时期的总RNA为材料,以18SrRNA作为内参基因,根据实验室抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)已获得的立枯丝核菌基因片段的表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)设计引物,采用实时定量RT-PCR检测A、B、C、E、F基因(分别为双组分反应调节子、激活巨噬细胞糖蛋白、胞外金属弹力蛋白酶、亲环蛋白、内质网囊泡蛋白ERV29)的表达,以期找到水稻纹枯病菌菌核形成中的差异表达基因。结果表明:从菌核开始形成到菌核成熟的过程中,这5个基因的表达量逐渐降低,且菌核在成熟时表达量最低,但成熟后这些基因的表达量迅速恢复到之前的水平,之后表达量基本保持不变。提示这5个基因在水稻纹枯病菌菌核形成的不同时期的表达有显著差异,说明这5个基因可能受菌核形成过程中胁迫条件的诱导表达。     

羧酸酯酶BioH的克隆表达及其水解活性的定向进化

通过分子克隆手段获得大肠杆菌来源的羧酸酯酶BioH,采用定向进化的方法提高该酶的水解活性以提升其应用价值.通过PCR扩增,从大肠杆菌K12菌株中克隆得到羧酸酯酶BioH基因,目的基因长度为771bp,含256个氨基酸;将其连接到pET30a(+)质粒上并转入BL21(DE3)宿主细胞中,经诱导表达得到所需的目的蛋白,该蛋白分子质量约为28.2ku.野生型的BioH水解对硝基苯丁酸酯(p-NPB)的活性为18U/mg,且该酶具有良好的热稳定性.以p-NPB为底物进行高通量筛选,其水解底物为对硝基苯酚(p-NP),在405nm处有最大吸收峰.挑选出水解活性提高的突变体,并通过2轮定向进化过程,成功筛选到7个水解活性提高的优良突变体,它们的活性分别提高了20%~100%.结构分析表明,突变体的突变位点均分布在远离活性中心的位置.     

小反刍兽疫病毒N基因部分片段克隆表达及鉴定

根据GenBank中登录小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列进行人工合成,在此基础上设计2对特异引物分别对N1、N5基因扩增和对N1和N5基因进行搭桥PCR连接,经测序分析后将N1-N5基因片段和原核表达载体pET-32a(+)相连接,构建pET-32a-N1-N5质粒。将pET-32a-N1-N5转化于TransB(DE3)原核表达感受态细胞后用IPTG诱导表达,将纯化重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果表明,所表达蛋白以可溶性形式表达并具有能与PPRV阳性标准血清发生特异性反应,为建立快速检测小反当兽疫病毒抗体水平诊断方法奠定基础。     

利用iTRAQ蛋白质组技术筛选与鸡喙畸形相关的候选蛋白

【目的】中国地方鸡种如北京油鸡、清远麻鸡存在喙畸形现象,表现为上下喙咬合不全,呈交叉状。严重影响鸡饮水和采食,从而影响个体发育和生产性能的发挥,造成一定经济损失。笔者根据喙畸形个体的系谱记录,发现喙畸形的形成受到遗传因素的影响,但具体机制尚不明确。蛋白是行使各种生物学功能的最终形式之一,喙畸形个体的发生可能是由于核心蛋白或者相关调控蛋白代谢异常造成的。利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术以及生物信息学分析方法,筛选鸡畸形喙与正常喙中差异表达的蛋白,作为喙畸形相关的重要候选蛋白,为进一步研究北京油鸡喙畸形的遗传机制奠定基础。【方法】挑选3只120日龄喙畸形的公鸡作为试验组,编号为W1、W2、W3,同时,挑选与试验组个体为同胞关系（全同胞或半同胞）的喙正常公鸡作为对照组,编号为Z1、Z2、Z3。将喙畸形与其同胞正常个体作为一个比对组,iTRAQ试验具体包含3个比对组,即W1 vs Z1,W2 vs Z2,W3 vs Z3。屠宰个体后,剔除喙组织周围肌肉和筋膜,分离得到喙上颌骨和下颌骨,提取总蛋白样品,应用6个 iTRAQ标签标记各蛋白样品,经过色谱层析预分离,联合液相串联质谱分析,采用Mascot 2.3.02软件对蛋白进行鉴定和定量分析。试验组（W）与其同胞对照组(Z)样本比较（W1 vs Z1,W2 vs Z2,W3 vs Z3）,选择肽段数≥2,表达差异值＞1.2（上调）或＜0.83（下调）,且P＜0.05的蛋白作为差异表达蛋白。【结果】利用iTRAQ技术一共在喙组织中鉴定到3 372个蛋白,鉴定到的特异性肽段有12 769个。其中原鸡蛋白1 869个,分子质量主要分布在10-100 kD之间。3个比对组共鉴定出159个表达量有显著差异的蛋白质,其中包含70个表达上调的蛋白,89个表达下调的蛋白。统计各比对组蛋白表达差异值发现,表达量差异较大的上调蛋白质有LPL、MLC-2、CO9A1、MATN3、HSP90B1等,表达量差异较大的下调蛋白质有MBP、RLA1、PRVM、HAPLN1等。结合已经报道的这些蛋白的生物学功能,其中CO9A1、MATN3、HAPLN1与软骨合成和软骨骨化相关,CO9A1是带状软骨纤维的组成物质,MATN家族是非胶原性细胞外基质蛋白家族,HAPLN1是软骨细胞外基质的重要组成成分;PRVM是细胞内钙离子结合蛋白,参与调控Ca2+离子信号通路;LPL是多功能酶,主要在脂质代谢和转运过程中起作用,参与调控PPAR信号通路。初步筛选出CO9A1、MATN3、HAPLN1、PRVM、LPL作为与鸡喙畸形相关的候选蛋白。【结论】差异表达蛋白的发现为鸡喙畸形形态的发生提供蛋白质水平上的理论依据。     

Tropomyosin基因在克氏原螯虾(Procambarus clarkii)卵巢发育过程中的表达

原肌球蛋白Tropomyosin是虾蟹类的主要致敏物质,除此以外在其他方面功能的研究非常少。本研究克隆了克氏原螯虾Tropomyosin基因,进行了同源序列比对,并分析了Tropomyosin基因在克氏原螯虾卵巢发育过程中的转录水平表达模式。研究结果显示,Tropomyosin蛋白序列高度保守,在虾蟹类甲壳动物中,8个抗原决定簇序列几乎完全一致。本研究克隆的基因存在3个核苷酸位置(c61—t,g118—a,c359—t)的变化,但是均不处于抗原决定簇内,免疫原性不受影响。Tropomyosin基因mR NA在克氏原螯虾卵巢组织中表达量很低,但是随着卵巢的发育存在表达差异,即呈现一个先提高再降低的峰型特征。本研究暗示Tropomyosin除过敏原特性外,可能也受性腺发育的部分调控影响。     

太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白(CP)的原核表达及条件优化

为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明:本研究中成功构建了重组载体p EVCP,表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000;目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;对重组菌株p EVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。     

用于RNA干扰研究的大肠杆菌表达系统的条件优化

选取在E.coli中对于dsRNA表达比较重要的3个因素,即诱导时间、诱导温度和诱导剂IPTG浓度。利用已经构建好的大肠杆菌E.coli HT115(DE3),并结合正交试验设计研究dsRNA在HT115(DE3)内的最优表达条件。结果表明,工程菌在诱导时间8 h、诱导温度30℃、诱导剂浓度10.0 mmol/L的培养条件下所得到的dsRNA表达量最大。     

地鳖虫提取物对大鼠运动能力和骨骼肌抗氧化酶活性的影响

【目的】探讨补充地鳖虫提取物对大鼠运动能力、骨骼肌抗氧化酶表达水平及活性的影响,以明确其作为运动补剂的可能性。【方法】对大负荷游泳训练大鼠按各组平均体质量的0.5,1.0和1.5g/kg剂量分别补充地鳖虫提取物,在8周大负荷训练结束后测定大鼠力竭游泳时间、骨骼肌抗氧化酶活性及其原因表达水平。【结果】8周大负荷训练后,与单纯大负荷运动组相比,补充地鳖虫提取物组大鼠运动能力显著提高,其骨骼肌SOD、CAT、GST3种抗氧化酶活性均显著增加,同时3种抗氧化酶编码基因的表达水平也显著上调。【结论】补充地鳖虫提取物能够显著提高大鼠运动能力和骨骼肌抗氧化酶活性,其可能的机理是地鳖虫提取物上调了抗氧化酶编码基因的表达水平。     

朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶真核表达载体构建及在293T细胞中表达条件

乙酰胆碱酯酶(AChE;EC 3.1.1.7)是神经传导中调节神经递质乙酰胆碱水平的一种关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的主要作用靶标。目前关于朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的真核表达还未见报道。本研究拟构建朱砂叶螨AChE的真核表达载体,进行在293T细胞中表达条件摸索。将朱砂叶螨野生型ace完整读框和去掉3’疏水区的ace基因分别插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,经PCR和双酶切鉴定及测序验证后,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/ace。采用GFP报告基因确定在293T细胞中表达条件摸索,结果表明293T细胞的最适转染时间为48h和LipofectamineTM2000转染试剂的最适加样量为20μL。本试验成功构建了朱砂叶螨AChE的真核表达载体,确定了在293T细胞中的表达条件,为后续筛选新型选择性AChE抑制剂奠定了基础。     

番茄LeABI3基因的克隆与植物过量表达载体的构建

从番茄成熟种子中提取总RNA,反转录得到cDNA.根据GenBank中番茄LeABI3基因序列设计引物,通过PCR方法获得了番茄LeABI3基因的2个转录本,其中转录本1序列比GenBank中LeABI3基因编码区序列多出30 bp,含1个1 740 bp的开放阅读框,编码579个氨基酸;转录本2比GenBank中LeABI3基因编码区序列也多出30 bp,同时在编码区内另一个位置因剪接而缺失了122 bp的核苷酸序列.通过替换掉植物过量表达载体PBI121上的GUS编码区序列,将序列无缺失的转录本1连接到PBI121上,对所获得的重组质粒进行双酶切,结果表明植物过量表达载体PBI121-LeABI3构建成功.